王永军,代晓微,严福军
(1绍兴第二医院·浙江 绍兴 312000;2吉林大学第二医院·吉林 长春 130041;3江西瑞昌市妇幼保健院· 江西 九江 332200)
马鬃蛇中含有多种氨基酸和微量元素,其在滋补强壮和祛风活血中有显著疗效,在民间常用于治疗血虚体弱和肾虚腰痛等病症[1]。现代研究表明,马鬃蛇对双相激素样小鼠的疗效显著[2]。马鬃蛇石油醚提取物(CVPEE)对ED大鼠的作用机制目前尚未见研究报道。有研究显示,细胞凋亡在维持阴茎海绵体细胞数量及功能方面发挥重要作用,贯穿动脉性勃起功能障碍发病的始末[3]。有学者研究发现,动脉性勃起功能障碍大鼠勃起功能差,阴茎细胞凋亡指数明显高于正常大鼠[4]。Caspase家族与细胞凋亡关系密切,其中位于凋亡通路下游的效应蛋白caspase-1起着关键作用,被认为是凋亡最可靠的指标[5]。本研究旨探究CVPEE通过调控Caspase-1对动脉性ED大鼠勃起功能及生育功能影响。
1.1 实验动物 成年雄性健康SD大鼠50只,体质量为220～240 g,均购自广州因明生物医药科技有限公司,许可证号SYXK(粤)2022-2027,经交配实验验证所有大鼠均有正常的勃起功能。
1.2 药物 马鬃蛇购自南京市郊;马鬃蛇石油醚提取物(CVPEE):本院研制,先将马鬃蛇的内脏取出并烘干,碾碎组织用乙醇醇渗漉提取石油醚萃取,将得到的干膏于冰箱保存。万艾可:辉瑞制药有限公司,国药准字H20020528。
1.3 试剂与仪器 阿朴吗啡(Apomorphine, APO)、Caspase-1、Bax、Bcl-2抗体:武汉博士德生物工程有限公司;荧光定量PCR试剂盒:Invitrogen公司;TUNEL检测试剂盒:上海碧云天生物技术有限公司;裂解缓冲液:美国Rockford公司。NE910显微镜:上海光密公司;PVDF 膜:美国Millipore公司。
2.1 动物分组和模型制备 50 只大鼠适应饲养3 d,随机分为假手术组10只和造模组40只。1%戊巴比妥钠(25 mg/kg)麻醉大鼠并沿大鼠腹部正中切开,充分暴露髂内动脉,用丝线结扎髂内动脉,缝合皮肤。假手术组大鼠只暴露髂内动脉,不结扎。在造模过程中造模组有2只大鼠造模失败,予以补充后进行后续实验。将成模大鼠随机分为模型组(灌胃等量生理盐水)、CVPEE低剂量组(2 g/kg)、高剂量组(4 g/kg)和阳性对照组(万艾可,12 mg/kg),每组10只;各组大鼠均灌胃给药,1次/天,连续给药21 d。
2.2 观察指标
2.2.1 勃起功能检测 1)APO实验:末次给药后24 h,参照文献[6]中对大鼠的勃起功能进行检测。将大鼠置于安静的笼中适应新环境10 min,取100 μg/kgAPO溶液于大鼠颈部皮下松弛皮肤注射,记录大鼠30 min内阴茎勃起次数。2)阴茎海绵体压力(ICP)测定:APO实验结束后,麻醉大鼠并处死,电针插入阴茎海绵体后计算其ICP值,电刺激穿刺针,每次刺激时间为60 s,20 min后进行下一次电刺激,观察ICP变化并记录。
2.2.2 生育功能检测 1)睾丸质量和睾丸指数:摘取大鼠左侧睾丸和附睾,吸取表面血迹,称取其质量,计算脏器指数。2)附睾精子数量及存活率:取大鼠右侧附睾浸泡于生理盐水中,用生理盐水稀释,计数精子数量;根据精子的活动情况,用显微镜计算活动百分比。
2.2.3 TUNEL检测阴茎海绵体组织细胞凋亡 取大鼠阴茎海绵体,一半置于多聚甲醛中固定,石蜡包埋,切片,烘干,冲洗干净后加入终浓度为20 mg/L Proteinase K溶液,室温孵育切片20 min;再次洗涤,加入1×Equilibration Buffer,孵育20 min后弃掉溶液,加入TdT溶液,孵育1 h(避光)。洗涤组织用DAPI染色,时长为5 min。显微镜观察细胞凋亡数量。凋亡率=(凋亡细胞数量/总细胞数量)×100%。
2.2.4 Western Blot检测阴茎海绵体组织Bax、Bcl-2和caspase-1蛋白表达 取-80℃冰箱保存的另一半阴茎海绵体,研磨匀浆,离心,收集并检测上清液中蛋白总浓度。配置浓缩和分离胶,将蛋白上样加入到胶孔中,电泳10 min后转膜。孵育PVDF膜2 h,在蛋白样本中加入封闭液,封闭PVDF膜1 h。加入一抗Bax、Bcl-2和caspase-1孵育过夜,继续加入HRP标记的二抗,继续孵育2 h。将ECL发光剂加入到细胞中曝光,用显影液显影,用Image Lab软件检测目的蛋白表达量。
3.1 CVPEE对大鼠勃起功能的影响 见表1。
表1 各组大鼠勃起次数和ICP值比较
3.2 CVPEE对大鼠睾丸指数和附睾指数的影响 见表2。
表2 各组大鼠睾丸和附睾重量和指数比较
3.3 CVPEE对大鼠精子密度和精子存活率的影响 见表3。
表3 各组大鼠精子密度和精子存活率比较
3.4 CVPEE对阴茎海绵体细胞凋亡率的影响 各组大鼠阴茎海绵体细胞凋亡率相比:模型组[(35.12±2.34)%]明显高于假手术组[(3.48±0.78)%](P<0.05),提取物低剂量组[(27.63±2.01)%]和提取物高剂量组[(12.54±1.25)%]、阳性组[(12.63±1.27)%]均低于模型组,提取物高剂量组低于提取物低剂量组(P<0.05),阳性组较提取物高剂量组无明显差异(P>0.05)。
3.5 CVPEE对各组大鼠阴茎海绵体组织Bax、Bcl-2和caspase-1蛋白表达影响 与假手术组相比,模型组Bcl-2蛋白表达降低,Bax和caspase-1蛋白表达升高(P<0.05);和模型组相比,低剂量组和高剂量组Bcl-2表达升高,Bax和caspase-1蛋白表达降低(P<0.05)。见图1。
注:与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与低剂量组比较,△P<0.05
研究发现ED发病率在10%～52%,尤以40～70岁男性居多。西方国家每年每1 000例男性人口中有25～30例新增勃起功能障碍病例。近年来调查显示,我国超过90%的60岁男性患者有勃起功能障碍性疾病[7]。近些年随着中医的发展,马鬃蛇治疗勃起功能障碍疾病受到学者们的广泛关注。动物实验结果显示,马鬃蛇醇提取物在对去势小鼠的治疗上,有一定的雄激素样作用[8];毒性研究结果显示,马鬃蛇醇提取物在临床的使用剂量上具有一定安全性[9]。以上研究结果为马鬃蛇的开发提供了科学依据,因此本研究建立动脉性ED大鼠模型,观察马鬃蛇石油醚提取物对大鼠的勃起功能和生育功能的影响。
目前动物实验研究中,检测阴茎勃起功能的方法常用APO实验和ICP实验[10]。本研究结果显示,模型组大鼠阴茎勃起次数和ICP值均降低,经过不同剂量CVPEE干预后大鼠阴茎勃起次数和ICP值明显增加,提示CVPEE可改善勃起功能。睾丸精曲小管上皮可产生大量精子,且其质量好坏严重影响着睾丸质量[11]。附睾可对精子进行暂时性的储存,可分泌大量的附睾液,进而对精子成熟有促进作用。因此,临床常用睾丸、附睾的重量反应生精功能,检测精液质量能直接反应大鼠的生育能力[12]。本研究结果显示,马鬃蛇石油醚提取物能改善大鼠的生育能力。刘雪梅等[13]研究证实,马鬃蛇可通过增加睾丸质量改善动脉性比起功能大鼠性功能障碍。
阴茎海绵体是勃起的重要组织结构,阴茎海绵体细胞凋亡和勃起功能障碍密切相关[14]。研究发现,细胞凋亡可维持生物体的正常发育,调控机体的内在平衡,且能有效去除机体内的癌细胞和受损细胞等[15]。生物的凋亡过程涉及多种相关基因共同作用。Bcl-2和Bax是最早被认识的凋亡调控基因,二者所编码的Bcl-2和Bax蛋白分别有抑制和促进凋亡作用,二者的平衡介导细胞的凋亡。Bcl-2家族是调控凋亡的核心因子,在不同的刺激下可调控抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax等。Wang等[16]研究证实,糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞大量凋亡,通过抑制细胞中Bax和Caspase-1表达减少细胞凋亡。Caspase家族中位于凋亡通路下游的效应酶Caspas-1蛋白起着关键作用,被认为是凋亡最可靠的指标。薛艳艳等[17]人研究证实,ED大鼠中caspase-1表达增加,其介导ED的发生发展。本研究结果显示,本实验结果显示,马鬃蛇石油醚提取物能减少阴茎海绵体细胞凋亡,调控Bax和Bcl-2蛋白平衡,抑制Caspase-1蛋白。
综上所述,马鬃蛇石油醚提取物可改善动脉性勃起功能障碍大鼠勃起功能和生育功能,可能和抑制阴茎海绵体细胞凋亡和Caspase-1蛋白表达有关。
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