张庆琛，刘应敏，朱晓琴，韩 霜，黄梦晴，裴冬丽
（1.商丘师范学院生物与食品学院·河南省特色微生物资源开发与应用工程研究中心 河南商丘 476000；
2.商丘师范学院化学化工学院 河南商丘 476000）
植物内生细菌（Endophyte）是定殖在健康植物组织内部，并与植物建立共生关系的一类微生物[1]。已有研究表明，植物内生菌最早发现于禾本科植物，如牧草等，现已发现广泛存在于至少80 个属的290 多种禾本科植物中，重要的经济林木如针叶类（冷杉、云杉、红杉、松、柏等）、阔叶类（栎树、桦树、桉树等）、灌木、草本植物以及栽培作物、果树、藻类和蕨类植物[2]。大量有益的内生菌在植物体内能产生营养物质（内生共生固氮）、激素等物质，参与植物的代谢过程，能够促进植物生长和增强植物抗逆、抗病、抗虫等能力[3]，这些特性引起了植物学家、植物生理学家、植物病理学家的高度关注。
薄荷（Mentha canadensis）为唇形科（Lamiaceae）薄荷属（Mentha）多年生草本中药材。薄荷中包含多类化合物如精油、多酚类、黄酮类等，被广泛地应用于抑菌[4-5]、抗病[6-7]、抗肿瘤[8]。截止到目前，薄荷内生菌的研究主要是内生细菌多样性及组成分析[9-10]，内生真菌筛选及多样性分析[11-12]，有关薄荷内生菌对植物促生、生物防治方面的研究鲜有报道。笔者从薄荷上分离并鉴定内生细菌，分析内生菌对不同病原菌的广谱抗性，同时对获得的拮抗菌进行鉴定，并进一步探讨拮抗菌对番茄黄萎病的生物防效及其生理机制，旨在为微生物菌剂的研发提供生防菌种和番茄黄萎病生物防治的分子机制研究提供理论参考。
1.1 材料
葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、禾谷镰刀菌（F.graminearum）和黄萎病菌（Verticillium dahliae）由商丘师范学院植物与微生物互作重点实验室提供，串珠镰刀菌（F.verticillioides）由河南农业大学提供。
2020 年5 月对示范园区温室内健康无病的薄荷（Mentha canadensis）进行内生细菌的分离，2022年4 月对室内盆栽的Moneymaker 番茄进行生物防效相关指标的测定。薄荷（Mentha canadensis）、Moneymaker 番茄由商丘师范学院植物与微生物互作重点实验室提供。
1.2 方法
1.2.1 薄荷内生细菌的分离、纯化与形态学观察
将新鲜无病薄荷的根、茎和叶用流水冲洗，室温晾干。用75%（φ，后同）乙醇消毒1 min 后无菌水冲洗5 次，再用2%NaClO 溶液浸泡1 min 后无菌水冲洗5 次。将消毒后的根、茎、叶分别加适量无菌水，研磨至匀浆，静置10 min，吸取100 μL 涂布于溶菌肉汤（LB）固体培养基平板，以最后一次的无菌水作对照。37 ℃恒温培养箱培养1～3 d，用接种环分别挑取平板中不同形态、大小、颜色等的菌落，平板划线纯化后获得单菌落，并对纯化后的单菌落进行形态学观察。
1.2.2 薄荷内生拮抗细菌的筛选 采用平板对峙培养法，以5 个供试菌株为病原菌，挑取病原菌菌饼置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板中心，于其周围同等距离（约距中心2.3 cm）3 处接种待筛薄荷内生细菌，以不接内生细菌作对照。于28 ℃恒温倒置培养，待对照的病原菌长满平板（直径为9 cm）时，观察对峙平板薄荷内生细菌对病原菌的抑菌效果；
利用病原菌与内生细菌两点划线法，测量对峙平板的病原菌向内生细菌扩展的距离，即处理菌落半径，并按下列公式计算抑菌率[13]，每个薄荷内生细菌对单一病原菌的抑菌率均由其3 个对峙平板计算，每个对峙平板测定3 个数据，即9 次重复。经筛选获得拮抗作用较好的菌株做进一步试验。
1.2.3 薄荷内生拮抗细菌生理生化鉴定 参照赵诗佳等[14]的方法对薄荷内生拮抗细菌菌株进行革兰氏染色试验、淀粉水解试验、吲哚乙酸试验、甲基红试验、过氧化氢酶试验、明胶液化试验，参照东秀珠等[15]的方法对薄荷内生拮抗细菌菌株进行乙酰甲基甲醇试验（V-P test）和乳糖、甘油、柠檬酸盐利用试验，参照夏明聪等[16]的方法测定薄荷内生拮抗细菌菌株生防特性相关的β-1，3 葡聚糖酶活性和蛋白酶活性。参照《常见细菌系统鉴定手册》[15]和《伯杰细菌鉴定手册》[17]对薄荷内生拮抗细菌菌株进行初步鉴定。
1.2.4 X7 菌株分子生物学鉴定 提取拮抗细菌基因组DNA，利用Mastercycler®nexus PCR 仪对其16S rDNA 进行PCR 分析。所用引物为：fD1（5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3’）和 rP1（5’-TACCTTGTTACGACTT-3’）。PCR 反应体系为50.0 μL：模板DNA 50～80 ng、上下游引物（10 μmol · μL-1）各1.0 μL、dNTP 5.0 μL、buffer（Mg2+）0.5 μL、Taq酶0.5 μL、ddH2O 补至50.0 μL。PCR 反应条件：94 ℃预变性3 min；
94 ℃变性30 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；
72 ℃延伸10 min。PCR 产物通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，委托南京金斯瑞生物科技有限公司对产物进行测序。所测序列递交GenBank，并通过BLASTn 对测定16S rDNA 基因序列进行同源性分析，利用MEGA 5.0 软件基于邻接法（Neighborhood Joining）构建系统进化树。
1.2.5 X7 菌株对番茄黄萎病的生物防效测定 取健康饱满的番茄种子消毒后，将番茄按照表1 进行3 种不同处理，即对照组、致病组、防病组。试验采用室内盆栽方式，按照表1 伤根法对长至5～6 片真叶的番茄植株接种黄萎病病原菌，处理至20 d 调查番茄的发病率，并按下列公式分别计算病情指数[18]和防治效果，每个处理3 次重复，每次重复10 盆，每盆种植1 株。发病程度分级标准参照陆家云等[19]的标准。0 级：外部无症状，植株健康；
1 级：病叶面积占总叶片的10%以下，叶脉间黄化；
2 级：病斑面积占总叶片的10%～50%，叶脉变黄且萎蔫；
3级：病叶面积占总叶片的50%以上，整株萎蔫；
4级：植株死亡。
表1 X7 菌株对番茄黄萎病生物防治的处理方式
1.3 数据处理
采用SPSS 17.0 软件基于Fisher LSD（最小显著性差异）法对数据进行显著性分析，采用Excel2019 绘制图表。
2.1 薄荷内生细菌的分离、纯化与形态学观察
从薄荷根、茎、叶组织中一共分离出25 株内生细菌菌株，根中9 株、茎中8 株、叶中8 株。根据菌落及菌体形态学特征观察，这25 株菌株被初步划分为4 个类型（图1），分别包含3、6、7、9 株内生细菌菌株。每个类型选取1 个菌株分别命名为X3、X6、X7、X9，菌落及菌体形态特征详见表2。
图1 薄荷内生细菌的4 种主要类型
表2 薄荷内生细菌的菌落形态特征
2.2 薄荷内生拮抗细菌的筛选
采用平板对峙培养法，将上述分离纯化的不同类型内生细菌菌株进行病原菌广谱抗性筛选。结果表明，薄荷内生细菌X7 和X9 菌株对葡萄座腔菌、尖孢镰刀菌、禾谷镰刀菌、黄萎病菌、串珠镰刀菌5 种供试病原菌均有抑制活性，对黄萎病菌的抑菌效果最好，抑菌率分别为73.33%、70.62%（表3）；
X7 菌株对5 种病原菌的抑菌率均略高于X9 菌株（图2，表3），说明X7 菌株拮抗活性较高，具有相对较大的生物防治潜力。
图2 薄荷内生细菌X7 和X9 对番茄黄萎病菌的拮抗作用
表3 薄荷内生细菌X7 和X9 对5 种病原菌的抑菌率 %
2.3 薄荷内生拮抗细菌生理生化鉴定
2.4 X7菌株分子生物学鉴定
以细菌基因组DNA 为模板，利用引物fD1/rP1经PCR 获得约1200 bp 的目的片段（图3），测序获得内生拮抗细菌X7 的序列长度为1163 bp，该序列提交至GenBank 后获得登录号（OM956127）。BLASTn 分析并下载较高同源性的序列，利用MEGA5.0 软件构建系统进化树。由图4 可知，X7菌株与贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis（MT013384）聚为一支。结合形态学观察和生理生化特征的结果，鉴定薄荷内生拮抗细菌X7 菌株为贝莱斯芽孢杆菌。
图3 薄荷内生拮抗细菌X7 菌株16SrDNA 的PCR 分析
图4 基于16S rDNA 序列构建的X7 菌株的系统进化树
2.5 X7菌株对番茄黄萎病的生物防效
采用表1 的处理方法，室内盆栽番茄接种黄萎病病原菌20 d 后，统计并计算薄荷内生拮抗细菌X7 对番茄黄萎病的生物防效指标列于表5。对照组番茄植株均未发病；
致病组的番茄植株几乎全部发病，病情指数达70.83；
拮抗菌X7 产生有活性的β-1，3 葡聚糖酶和蛋白酶（表4）可有效抑制番茄黄萎病菌的正常生长，防病组番茄植株的发病率和病情指数显著下降，防治效果达到67.16%。结果表明，薄荷内生拮抗细菌X7 对番茄黄萎病的生物防效较好。
表4 薄荷内生拮抗细菌X7 和X9 的生理生化特征
表5 薄荷内生拮抗细菌X7 对番茄黄萎病的生物防效
笔者的研究共分离获得25 株薄荷内生菌株，经抑菌谱筛选获得2 株薄荷内生拮抗细菌X7 和X9，对番茄黄萎病的抑菌率分别为73.33%和70.62%，X7 拮抗活性更高；
经鉴定X7 为贝莱斯芽孢杆菌。基于确立种分类地位较晚[20-21]，贝莱斯芽孢杆菌存在菌种资源保藏量较少的问题[22]。已有研究表明，贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）2A-2B[23]能有效拮抗辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、茄病镰刀菌（F.solani）、尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani），抑菌率在60%以上；
B.velezensisYP2[24]能 有 效 拮 抗Cercesporaspp.、Septoriasp.、Phomasp.、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）和油菜菌核病菌（Sclerotinia scleotiorum）等真菌。这与笔者研究的贝莱斯芽孢杆菌X7 菌株对供试真菌病原菌的抑制效果类似，进一步证明贝莱斯芽孢杆菌确有抑菌谱广的特性；
笔者获得的贝莱斯芽孢杆菌X7 菌株丰富了贝莱斯芽孢杆菌菌种资源。
番茄黄萎病（V.dahliae）是番茄生产特别是保护地栽培的重要病害之一，严重降低了番茄的产量和品质[25]。前人研究结果表明，贝莱斯芽孢杆菌能够有效防治小麦纹枯病[16]、红叶芥菜白粉病[24]、日本大叶黄杨炭疽病[26]、稻瘟病[27]、松材线虫[28]、番茄青枯病[29]等，展现出较广泛的生物防效。笔者研究证明，贝莱斯芽孢杆菌X7 菌株显著降低了盆栽试验番茄的黄萎病发病率、病情指数，生物防效较佳；
分析发现该菌株能够产生有活性的β-1，3 葡聚糖酶和蛋白酶，这些酶能够降解病原菌细胞壁中的β-葡聚糖、蛋白质[30-31]，这是贝莱斯芽孢杆菌X7 菌株有效生物防治番茄黄萎病的重要生理机制之一，有关其防治番茄黄萎病的分子机制尚需进一步研究。笔者拟利用致病组和防病组的番茄植株，通过转录组与代谢组的联合分析进一步探讨X7 防治番茄黄萎病的诱导系统抗性的分子机制。
笔者的研究结果表明，从薄荷获得的贝莱斯芽孢杆菌X7 是一株极具生防菌剂研发潜力的菌株，可用于番茄黄萎病的防治。同时，研究结果可为贝莱斯芽孢杆菌防治番茄黄萎病分子机制的探讨提供材料支撑和理论参考。
猜你喜欢莱斯黄萎病薄荷莱斯安全阀门（天津）有限公司.流程工业(2022年11期)2022-11-30那盆猫薄荷 终读友·少年文学(清雅版)(2020年6期)2020-10-20那盆猫薄荷 4读友·少年文学(清雅版)(2020年4期)2020-08-24那盆猫薄荷(2)读友·少年文学(清雅版)(2020年2期)2020-06-15那盆猫薄荷 1读友·少年文学(清雅版)(2020年1期)2020-05-20莱斯·布朗的故事将改变你的生活疯狂英语·新策略(2019年8期)2019-10-18天麻抗真菌蛋白基因或可防治棉花黄萎病中国食用菌(2016年4期)2016-01-25不同枯草芽孢杆菌制剂防治棉花黄萎病药效试验新疆农垦科技(2014年7期)2014-02-28深翻对长期连作棉田黄萎病防治效果的调查分析新疆农垦科技(2014年6期)2014-02-28棉花黄萎病拮抗菌的筛选及其生物防治效果植物营养与肥料学报(2012年1期)2012-10-26