陈武瑛, 陈 昂, 李凯龙, 罗香文, 熊 浩,刘志邦, 宋增收, 刘 勇
(湖南省农业科学院 植物保护研究所，长沙 410125)
苯醚甲环唑是一种三唑类杀菌剂，具有高效、广谱和内吸传性强的特点，广泛应用于水果和蔬菜等作物上。研究表明，苯醚甲环唑在田间施用会对蚯蚓和土壤微生物等产生影响，例如，可抑制蚯蚓体内谷胱甘肽过氧化物酶活性[1]，改变土壤中微生物群落组成[2]，对土壤中的真菌产生毒害作用[3]等，进而影响农田的可持续利用。因此，评估苯醚甲环唑对土壤生物的风险对于其安全使用具有重要的指导作用。目前，在对土壤生物的环境风险表征时，多使用通过保守假设模型计算获得的预测暴露浓度(PEC)与预测无效浓度(PNEC)进行比较[4]。近年来有研究者采用土壤中农药残留的实测值结合 PNEC 计算风险商值，用于表征农药对蚯蚓的风险[5-6]。实测田间土壤中农药残留浓度对土壤生物风险进行评价，更接近于田间真实情况。
目前，在芹菜上有43 个杀菌剂登记产品，其中苯醚甲环唑23 个，占杀菌剂的53.5%[7-8]。芹菜生长周期短，可食用部分均为农药喷施部位，且采收间隔期短，残留风险高[9]，因此芹菜成为了蔬菜中农药残留监测的代表性品种之一[10]。焦晓伟等[11]对山西省芹菜调查中发现，农药残留的检出率为93.3%，其中苯醚甲环唑的检出率为16.7%；
汤晗等[10]对浙江省芹菜调查中发现，苯醚甲环唑检出58 次，其中4 次超过最大残留限量MRL 值(3 mg/kg，中国)，最高残留值为4.79 mg/kg。因此，芹菜中苯醚甲环唑的残留行为和膳食摄入风险格外值得关注。
关于农药在芹菜中的残留行为和膳食摄入风险评估方面已有不少报道[12～14]，但关于苯醚甲环唑在芹菜中残留的研究仅有少量报道。苯醚甲环唑最终残留量随着施药剂量和施药次数的增加而增加，随着采样间隔期的延长而减小[15]。李艳杰等[6]报道苯醚甲环唑在设施芹菜叶中的半衰期小于11.4 d，芹菜叶和茎中的最终残留量分别为3.14～10.5 和0.14～0.73 mg/kg，目前尚未见有关其环境风险评估和膳食暴露风险方面的研究报道。本研究开展了10%苯醚甲环唑水分散粒剂在露地芹菜中的残留试验，并在室内进行了土壤生物的急性毒性试验。根据土壤中的残留数据，结合毒性端点值评估了其对土壤生物的暴露风险。根据芹菜中的残留数据，结合居民膳食数据资料，对苯醚甲环唑的膳食摄入风险进行了评估。旨在为苯醚甲环唑在农产品和环境中的安全使用提供科学依据。
1.1 仪器与试材
液相色谱-质谱联用仪系统：LC1290液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；
SCIEX 4500质谱仪，AB 公司；
CPA225D 电子天平，德国赛多利斯股份公司；
Centrifuge 5424 离心机，Eppendorf；
TD5.5 离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司；
VS-2500T 多管旋涡混合器，无锡沃信仪器有限公司。
试剂：99.5%苯醚甲环唑 (difenoconazole) 标准品，Xstandard；
水，超纯水；
甲酸(色谱纯)，美国ROE；
乙腈(色谱纯)，默克化工技术(上海)有限公司；
乙腈和NaCl，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；
C18、PSA 和GCB (分析纯)，天津博纳艾杰尔科技有限公司。
供试农药：10%苯醚甲环唑水分散粒剂 (WG)，PD20152176，先正达南通作物保护有限公司。登记在芹菜上防治芹菜叶斑病，芹菜生长中期进行喷雾施药，推荐剂量为有效成分90～120 g/hm2，施药次数为3 次，采收间隔期为5 d。
供试生物：赤子爱胜蚓Eisenia foetida从岳阳岳峰蚯蚓养殖基地引进成蚓，经实验室内驯养和饲养。选择体重在300～600 mg 之间、有明显生殖带、体色较深、蠕动能力强的成蚓供试。
1.2 室内毒性测定试验
参照《化学农药环境安全评价试验准则》[16]，在室内条件下，采用人工土壤法开展蚯蚓的急性毒性测定试验，采用氮转化法开展土壤微生物毒性测定试验。试验结果采用SPSS 统计软件处理，获得10% 苯醚甲环唑WG 土壤生物的毒性端点值。
1.3 田间试验
在湖南长沙和山东齐河两地采用当地常规品种 (长沙：柳兴雪白芹菜；
齐河：
四喜芹菜) 进行露地栽培。于芹菜生长中期施药，小区面积20 m2，每个处理3 个重复；
选一块20 m2的地块，单独用于土壤施药。按最高推荐剂量有效成分120 g/hm2喷雾施药3 次，施药间隔期5 d。每次施药均于药后2 h 采样，于最后一次施药后2 h和1、2、3、5、7、14、21、28 d 以5 点法采集芹菜和土壤样品，同时设不喷施农药的对照小区。
1.4 分析方法
1.4.1 样品前处理 称取10.0 g 均质样品于50 mL具塞离心管中，加入50 mL 乙腈，涡旋提取5 min，加入5.0 g 氯化钠，涡旋30 s 后于4 000 r/min 下离心5 min。取1.5 mL 上清液，加入装有C1850 mg和PSA 50 mg 的EP 管(叶和茎处理时再加入GCB 20 mg) 中，涡旋1 min，于12 000 r/min 下离心5 min。取上清液，过0.22 μm 有机滤膜，待测定。
1.4.2 色谱和质谱检测条件 20RBAY RRHD Eclipse plus C18色谱柱(3.0 mm × 100 mm，1.8 μm)；
柱温30 ℃；
进样量1 μL；
流动相A 相为乙腈，B 相为0.1%甲酸水溶液；
流速0.40 mL/min；
柱温40 ℃。
离子源类型：ESI+；
离子源温度500 ℃；
气帘气压力241 kPa ；
喷雾气压力310 kPa ；
辅助加热气压力310 kPa ；
离子化电压5 500 V；
多重反应监测模式 (MRM) 检测；
定量离子406/250.9，碰撞电压31 V，射入电压12 V；
定性离子406/188.0，碰撞电压61V，射入电压14 V；
保留时间2.25 min。
1.4.3 标准曲线和添加回收试验 称取苯醚甲环唑标准品10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1 000 mg/L 的母液。用乙腈逐级稀释成1、0.5、0.1、0.05、0.01 和0.001 mg/L 的系列标准工作液。空白样品分别经1.4.1 节中的提取净化过程得到空白基质溶液。用空白基质溶液逐级稀释母液，配制成系列质量浓度的空白基质匹配标准溶液。按1.4.2 节的条件测定，以标准溶液的质量浓度 (x)为横坐标，以其对应的峰面积 (y) 为纵坐标绘制标准曲线。
称取10.0 g 空白样品(叶、茎和土壤)于50 mL离心管中，加入标准工作溶液，添加水平分别为0.01、0.1、1 和20 mg/kg，按照1.4.1 和1.4.2 节中条件进行前处理及检测。每处理重复5 次，计算添加平均回收率及相对标准偏差(RSD)。
1.5 膳食摄入风险评估
短期膳食摄入风险采用 JMPR 推荐的方法，按公式 (1) 计算国家估算短期摄入量(NESTI)[17-20]。
式中：NESTI 为短期摄入量的估计值，mg/kg bw·d；
HR 为最大残留值，mg/kg；
LP 为大份餐，即食品的最大消费量，kg/d；
ʋ 为个体之间变异因子；
bw 为体重，kg。
根据 WHO GEMS/FOOD (全球环境监测系统/食品污染监测与评估规划) 公布的数据[19]：芹菜的平均单份质量为0.86 kg，芹菜在普通人群和1～6 岁儿童大份餐LP 分别为0.305 9 和0.180 3 kg，普通人群体重按53.23 kg 计，1～6 岁儿童体重按16.14 kg 计，其中芹菜变异因子取3。
短期风险商按公式(2)计算[17-20]。
式中：
RQa为短期风险商；
ARfD 为急性参考剂量，mg/kg bw。
当 RQa≤ 1 时，认为其短期膳食摄入风险处于可接受水平；
当RQa＞ 1 时，则认为其短期膳食摄入风险不可接受。
依据WHO GEMS/FOOD 中公布的我国居民膳食结构和消费数据，结合本研究获得的残留中值，按公式(3) 和(4) 计算长期膳食摄入暴露风险[17-20]。
式中：NEDI 为每日摄入量估计值，mg/kg bw·d；
STMRi第i类初级食用农产品的规范试验残留中值，mg/kg；
Fi为第i类食品的摄入量，kg/d；
bw 为体重，kg；
RQc为长期风险商；
ADI 为每日允许摄入量，mg/kg bw。
当RQc≤ 1 时，表示风险可以接受，数值越小，风险越小；
当RQc＞ 1 时，表示有不可接受的长期风险，数值越大，风险越大。
鉴于目前仅获得了苯醚甲环唑在芹菜一种食用农产品上的残留试验数据，并无在其他登记作物上的 STMR 值，因此不能计算其包含所有登记作物在内的膳食暴露NEDI 值，故只计算芹菜中苯醚甲环唑残留膳食暴露占NEDI 的份额以及对RQc的贡献率(RQc%)。
1.6 土壤生物环境风险评估
依据NY/T 2882.8—2017《农药登记环境风险评估指南 第8 部分:土壤生物》[21]对土壤生物进行环境风险评估。根据毒性端点值、预测土壤环境浓度，按公式(5)和(6)计算环境暴露风险：
式中：PNEC 为预测无效应值，mg/kg；
Enp 为试验毒性端点值，如LC50值和EC25值等，mg/kg；
UF 为不确定性因子；
PEC 为农药的预测土壤最大值，本次评估采用实测暴露量(MEC)，mg/kg；
RQe为环境风险商。
当RQe≤ 1 时，表示风险可以接受，数值越小，风险越小；
RQe＞ 1 表示风险不可接受；
当初级急性风险评估中RQe＞ 1，或受试农药在土壤中累积风险消解半衰期DT50＞ 180 d，需要进行土壤生物的慢性效应评估。
2.1 分析方法有效性评价
结果 (表1) 表明：苯醚甲环唑的溶剂标准曲线和基质标准曲线在0.001～1 mg/L 范围内均具有良好的线性关系 (R2≥0.99)。本研究采用基质效应(Me)＝(基质标准曲线斜率/溶剂标准曲线斜率-1) × 100% 的方式评价基质效应。当Me大于0时，为基质增强效应；
当Me小于0 时，为基质抑制效应[22-23]。结果表明：苯醚甲环唑在3 种基质中的基质效应为-5.4%～-0.9%，均为弱抑制效应。尽管基质效应较弱，为保证结果的准确性，本研究仍采用基质标准曲线进行校正。
表1 方法的线性方程、决定系数和基质效应(线性范围：0.001～1 mg/L)Table 1 Linear equations, determination coefficients and matrix effects of the established method(linear range: 0.001-1 mg/L)
添加回收试验结果(表2) 表明：在0.01～20 mg/kg 添加水平下，苯醚甲环唑在芹菜叶中的平均回收率为93%～108%，RSD 为4.6%～9.8%；
在茎中的平均回收率为84%～99%，RSD 为2.2%～9.5%；
在土壤中的平均回收率为92%～98%，RSD为5.6%～8.6%。苯醚甲环唑的方法检出限(LOD)为0.001 mg/L，根据SANTE/11312/2021[24]以最低添加水平作为分析方法的定量限(LOQ)，其在3 种基质中的LOQ 均为 0.01 mg/kg。分析方法的准确性和重现性均能满足农药残留分析要求[25]。
表2 苯醚甲环唑在芹菜叶、茎和土壤中的添加平均回收率和相对标准偏差Table 2 The recoveries and RSD of difenoconazole in celery leaf, stem and soil
2.2 苯醚甲环唑在芹菜中的沉积、消解与残留
在露地栽培条件下施药3 次，每次施药2 h 后采集样品检测，发现苯醚甲环唑在芹菜叶、茎和土壤中的原始沉积量分别为14.5～17.9、2.9～4.4和1.5～3.0 mg/kg (图1)，3 者之间无明显的叠加效应。苯醚甲环唑在芹菜中2 h 的沉积结果与胡家萌等[9]报道的苯醚甲环唑在生菜上的原始沉积量为8.9～11.87 mg/kg 的结果接近。芹菜叶的表面积大于茎，农药更易沉积在叶上[26]，这可能是芹菜叶相较于茎成为农药主要沉积部位的原因。
图1 苯醚甲环唑在芹菜叶、茎和土中的原始沉积量Fig.1 The original sedimentation of difenoconazole in celery leaf, stem and soil
苯醚甲环唑随时间推移逐渐消解，且呈现先快后慢的趋势，其消解动态均符合一级反应动力学方程，在芹菜叶、茎和土壤中的消解半衰期分别为5.2～8.8 d、8.0～8.2 d 和13.6～15.0 d，均为易降解农药[27-28](表3)。究其原因：随着采样时间间隔的增长，芹菜生长较快，对农药产生了稀释作用，导致单位质量的芹菜中农药的量减少；
芹菜生长过程中阳光的照射对苯醚甲环唑消解也是主要影响因素[15]。李艳杰等[7]报道，苯醚甲环唑在设施芹菜叶片中的消解半衰期为10.1～11.4 d，略慢于本研究露地条件下的消解。这可能是由于在露地条件下，黏附在芹菜叶中的农药受阳光、雨水等气候因子的影响较大；
而在设施条件下，处在相对封闭的环境中，受外部自然条件的影响较小，因此消解较慢[29]。
表3 苯醚甲环唑在芹菜叶、茎和土壤中的残留量及消解参数(n=3)Table 3 The residues and dissipation parameters of difenoconazole in celery leaf, stem and soil (n=3)
10%苯醚甲环唑WG 在露地芹菜中以有效成分120 g/hm2剂量喷施3 次，施药间隔期5 d。结果表明：距最后一次施药5 d 收获时苯醚甲环唑在芹菜叶中的残留量为2.9～9.7 mg/kg，茎中为0.58～1.5 mg/kg，土壤中为1.1～2.0 mg/kg。按照芹菜叶片和茎质量比3 : 63[7]计算，则在芹菜整株中的残留量为0.88～1.5 mg/kg。由于芹菜自身的蜡状表面、叶片气孔分布以及特殊的维管结构，使得其较容易吸附农药，不利于农药的降解，从而导致了芹菜中农药残留量较高[9,30]。苯醚甲环唑在芹菜叶片中的残留量高于MRL (3 mg/kg，中国)，在茎和整株芹菜中的残留量则均低于MRL。
2.3 膳食摄入风险评估
苯醚甲环唑的急性参考剂量 (ARfD) 值为0.3 mg/kg bw[31]。采用采收间隔期5 d 时苯醚甲环唑在芹菜中的残留试验最大残留量 (HR) 值，计算得出普通人群的国家估算短期摄入量 (NESTI) 值为0.026 mg/kg bw·d，短期膳食摄入风险商 (RQa)值为0.09；
1～6 岁儿童的NESTI 值为0.030 mg/kg bw·d，RQa值为0.10。通过摄入芹菜中的苯醚甲环唑对普通人群和1～6 岁儿童均不会产生短期膳食摄入风险。两者食物构成及体重等因素不同而造成其短期膳食摄入风险存在差异。
苯醚甲环唑的每日允许摄入量 (ADI) 值为0.01 mg/kg bw[32]。根据WTO 关于中国不同年龄段人群对芹菜的消费量调查数据[19]，结合本研究获得采收间隔期5 d 时苯醚甲环唑在芹菜整株中的残留试验中值(STMR)为1.2 mg/kg，计算每日摄入量和风险商值。由表4 中数据可得出：对于不同人群，芹菜中苯醚甲环唑对长期膳食摄入风险商的贡献率RQc%值为9.4%～19.8%。其中3～5 岁儿童的贡献率高于其他年龄段人群。
表4 中国不同人群对芹菜的平均消费量和长期膳食摄入风险商贡献率Table 4 Mean consumption and RQc% of difenoconazole for different populations in China
膳食风险评估的不确定性分析：1) 清洗、脱皮和烹调等加工过程可以显著降低食品中农药残留量[33]，本次评估未考虑加工过程中的残留损失，这也会相应增加风险不确定性，提高风险评估的保守性程度。2) 本研究仅进行了两地的规范残留试验，因此所得评估结果还较为初级，尚需结合更多试验点的残留数据，以使得风险评估结果更完善、合理。3) 本次评估基于残留试验数据，但是农药施用在实际操作中可能与标签规定不一致[34]。因此还需要食品安全监测数据进一步评估其膳食摄入风险。
2.4 土壤生物环境风险评估
蚯蚓急性毒性试验结果显示，空白对照组未观察到中毒症状，处理组出现蚯蚓蠕动能力减弱、尸体腐烂等症状。10%苯醚甲环唑WG 对蚯蚓的急性毒性7 d-LC50值为有效成分 (下同) 42.9 mg/kg，其95% 置信限为33.4～57.8 mg/kg，回归方程为y= -2.981 08 + 1.826 37x，回归系数R2=0.984；
急性毒性14 d-LC50值为33.7 mg/kg，其95%置信限为26.7～42.6 mg/kg，回归方程为y= -3.168 24 + 2.074 66x，R2= 0.995。通过计算硝酸盐形成速率得出10%苯醚甲环唑WG 对土壤微生物的毒性。结果表明：28 d-EC25值为8.16 mg/kg，其95%置信限为3.67～45.5 mg/kg，回归方程为y= -1.174 62 + 0.548 66x，R2= 0.908。EFSA[35]报道，苯醚甲环唑对蚯蚓的急性毒性14 d-LC50＞610 mg/kg，采用氮转化法测得对微生物的28 d-EC25值为1.67～16.7 mg/kg，本研究中蚯蚓的急性毒性高于该报道，而微生物的毒性与该报道接近。张国福等[36]的研究表明，不同剂型苯醚甲环唑及原药对斑马鱼的急性毒性存在差异。即使是同一有效成分、相同剂型、相同含量的不同制剂，由于不同生产厂家加工工艺的不同，也会出现毒性级别的差异[37]。采用毒性端点、不确定因子和土壤中的残留量计算10%苯醚甲环唑WG 对土壤生物的暴露风险。初级风险评估结果表明：苯醚甲环唑对土壤生物的初级急性风险商值 (RQe)在0.368～0.890 之间，均小于1 (表5)，即苯醚甲环唑对蚯蚓和土壤微生物的初级急性风险可接受。EFSA[35]评价苯醚甲环唑对蚯蚓和微生物的急性风险均为低风险，本研究的结果与之相似。10%苯醚甲环唑WG 对土壤生物的环境暴露风险小于1，且苯醚甲环唑在土壤中的消解半衰期为13.6～15.0 d，小于180 d，根据该指南可认为苯醚甲环唑在土壤中无慢性积累风险。
表5 10%苯醚甲环唑WG 的环境风险评估Table 5 The environmental risk assessment of 10% difenoconazole WG
本研究采用液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS)法，在多反应监测模式(MRM)下，对芹菜叶、茎和土壤中苯醚甲环唑残留进行了定性和定量分析。结果显示，所用方法稳定性好、灵敏度高、高效快捷，适合于芹菜叶、茎和土壤中苯醚甲环唑的定量分析。
采用10%苯醚甲环唑WG 在露地芹菜栽培模式下以有效成分120 g/hm2剂量喷雾施药3 次，施药间隔期5 d。结果表明：苯醚甲环唑在芹菜叶、茎和土中的原始沉积量分别为14.5～17.9 mg/kg、2.9～4.4 mg/kg 和1.5～3.0 mg/kg。苯醚甲环唑在芹菜叶、茎和土壤中的消解半衰期分别为5.2～8.8 d、8.0～8.2 d 和13.6～15.0 d，均为易降解。距最后一次施药5 d 收获时醚甲环唑在芹菜叶片中的残留量高于MRL (3 mg/kg，中国)，在茎和整株芹菜中的残留量则均低于MRL。建议消费者只食用芹菜茎，不食用或减少芹菜叶片的食用量。
根据所得残留试验数据进行了长期和短期膳食摄入风险评估。计算得出食用芹菜中苯醚甲环唑对普通人群和1～6 岁儿童的短期膳食摄入风险商 (RQa) 值分别为0.09 和0.10；
对于不同人群，芹菜中苯醚甲环唑对长期膳食摄入风险商的贡献率 (RQc%) 值为9.4%～19.8%。采用毒性端点、不确定因子和土壤中的残留量计算10%苯醚甲环唑WG 对土壤生物的暴露风险。初级风险评估结果表明：苯醚甲环唑对土壤生物的初级急性风险商值 (RQe) 为0.368～0.890，均小于1。即苯醚甲环唑对蚯蚓和土壤微生物初级急性风险可接受。10%苯醚甲环唑按推荐的施药时期、剂量和方法在露地芹菜上施药，严格依照安全间隔期进行采收，膳食摄入风险和对土壤生物的环境风险均为可接受。