邵晨宁，黄国庆，李明才
根据2011年IASLC/ATS/ERS肺腺癌国际多学科分类，将肺腺癌分为非典型腺瘤样增生（AAH）、原位腺癌（AIS）、微浸润性腺癌（MIA）和浸润性腺癌（IAC）[1]。手术切除是肺腺癌的主要治疗方式，《中华医学会肿瘤学分会肺癌临床诊疗指南（2021版）》推荐AIS和MIA行亚肺叶切除术，IAC通常需要全肺叶切除。在早期肺癌中，亚肺叶切除与肺叶切除相比，患者的总生存率和癌症特异性生存率没有差异[2-3]。手术医生基于术中冰冻诊断来选择肺叶切除或者亚肺叶切除，因此，在术中准确做出肺腺癌的分类诊断至关重要[4]。本研究回顾性收集经石蜡切片确诊为肺腺癌并做过术中冰冻切片的病例823例，以石蜡切片诊断为“金标准”，对比分析冰冻切片诊断对肺腺癌分类诊断的符合率，现报道如下。
1.1 一般资料 以肺腺癌为关键词，收集2020年9月至2021年4月送检宁波市临床病理诊断中心的术中冰冻切片诊断为肺腺癌的病例823例，合计病灶934个，均经术后石蜡切片诊断确诊。其中男222例，女601例；
年龄18～85岁，平均（53.7±13.7）岁。本研究经宁波大学医学院伦理委员会审批通过。
1.2 方法
1.2.1 术中冰冻切片诊断方法 标本为手术中送检的新鲜肺组织，高年资病理医生取可疑结节处放于样本托，多病灶肺组织按需取多块组织，胶水包埋，将样本托置于赛默飞FSE恒温冷冻切片机的速冻台，当观察到胶水及组织下半部颜色变白呈冰冻状态时，轻轻地将冻锤压于组织上，待组织完全冰冻后切片，切片厚度6m，贴片后立即甲醇固定1 min，苏木素伊红染色，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶湿封，显微镜观察。
1.2.2 术后石蜡切片诊断方法 将冰冻及冰剩组织用10%中性缓冲甲醛充分固定后，放入达科为全自动脱水机进行脱水浸蜡处理，取出后包埋，用LEICA2235轮转式切片机切片，切片厚度4m，DAKO全自动染封一体机染色封片，镜下观察。
1.3 诊断结果判读 冰冻切片结果均由高年资病理医生判读，其中的疑难片通过科内会诊判定；
石蜡切片中的疑难片通过科内复片会诊，加做免疫组化或组织化学特殊染色等方式进行判定。以石蜡切片诊断结果为“金标准”，将冰冻切片结果分为确诊和误诊，确诊又包括：（1）完全符合：指冰冻和石蜡切片诊断完全一致；
（2）基本符合：良恶性一致，恶性的分类（浸润程度）不一致。误诊：指冰冻和石蜡的良恶性不符，假阳性是指将良性诊断为恶性，假阴性是指将恶性诊断为良性。
1.4 统计方法 采用SPSS 22.0统计软件进行分析，冰冻切片和石蜡切片两种方法的良恶性诊断差异采用Kappa一致性检验和配对2检验，两种方法对病灶分类诊断的差异采用配对2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
2.1 冰冻切片和石蜡切片的良恶性结果比较 为求精确，以单个病灶为对比样本。本组合计934个病灶，冰冻切片的阳性诊断率为99.1%，石蜡切片的阳性诊断率为99.3%；
两种方式对良恶性的诊断结果基本一致，但一致性中等（Kappa=0.530，P＞0.05），见表1。
表1 冰冻切片和石蜡切片的良恶性结果 个
2.2 冰冻切片和石蜡切片的分类诊断结果比较 冰冻切片与石蜡切片结果完全符合690个（73.88%），基本符合237个（25.37%），误诊7个（0.75%），两者的分类诊断差异有统计学意义（P＜0.001），见表2。
表2 冰冻切片和石蜡切片的分类诊断比较 个
2.3 冰冻切片和石蜡切片的HE染色 可见冰冻切片相对于石蜡切片细胞稍肿胀，细胞核结构稍显模糊，操作不当时容易出现冰晶，组织结构易变形，见图1～2。
图1 冰冻切片和石蜡切片（HE染色，×40）
亚肺叶切除术已被临床作为AIS和MIA的首选治疗方式[5]，但国际上对肺癌术中冰冻切片诊断的看法不一，有学者认为冰冻切片诊断误差较大且影响因素太多，对手术方式的选择有重大影响[6-8]；
也有学者认为冰冻诊断与石蜡诊断符合率较高，对手术方式选择有极高的参考价值[9-12]。本研究结果显示两种制片方式的良恶性诊断一致性一般，分类诊断差异有统计学意义，这与文献[8-9，13]报道结果相似。分类诊断差异具体表现在：（1）冰冻诊断对AIS和MIA的区分存在困难；
（2）冰冻诊断对IAC的诊断难度较大，易将IAC诊断为MIA。临床上，AIS和MIA的手术处理方式一样，所以这两者的冰冻结果区分意义不大[9-10]。IAC通常需要全肺叶切除及淋巴结清扫，对患者预后影响重大，所以必须提高术中IAC诊断的准确率。因此本研究重点关注IAC诊断出现偏差的原因。
图2 冰冻切片和石蜡切片（HE染色，×200）
本研究结果显示有80个病灶冰冻切片诊断为MIA，石蜡切片诊断为IAC，冰冻诊断过于保守。分析原因如下：第一，送检组织的取材偏差。冰冻取材全凭肉眼观察和经验，这与取材医生的主观判断大有关系，所以冰冻取材很难达到常规取材的完整、全面。有学者认为全面取材可能可以降低诊断偏差，但在实际操作中存在困难。第二，冰冻切片质量影响较大。肿瘤细胞是否有间质或肺泡腔内的聚集及浸润灶的大小，是肺腺癌分类诊断的依据。在冰冻制片时，冻锤的使用时机至关重要，因肺不是实性组织，使用过早易将组织块压扁变形，使用不及时则会产生冰晶增加细胞的异形性，影响诊断。且未经固定的肺泡腔容易塌陷，使得贴壁的肿瘤细胞聚集在肺泡腔内，对浸润深度的判读产生干扰。再者，通常冰冻切片不会深切，而常规制片显示出更进一步的浸润，这种情况偶有发生。第三，冰冻切片判读的偏差。当冰冻切片的镜下表现不明确时，不同病理医生可能有不同的判断。因术中冰冻要求在30 min内报告结果，除去制片时间，留给诊断医生的时间不多，压力不言而喻，以至于在诊断时偏向于保守。另外，冰冻切片比石蜡切片厚，在镜下会看到细胞重叠，新鲜未经固定的细胞稍大，核也容易肿胀变形，这些都加大了诊断难度。
尽管冰冻切片对肺腺癌的分类诊断一致性还存在争议，但术中冰冻切片诊断已经广泛运用在外科手术中，因此，如何提高其准确率是病理医师努力的方向。针对以上分析作如下建议：第一，手术医生在冰冻申请单上应尽可能详细地填写病史、影像资料及手术所见等，肺组织应尽快送检，避免沾水。对微小病变最好染色或者系线标记，以协助病理医生快速找到病灶。病理医生在取材时应注意取材刀锋利，避免来回拉锯损伤细胞。第二，冰冻切片应由经验丰富的病理技术员制作，肺组织要求快速冷冻，有条件的单位可以使用液氮来速冻组织。以石蜡切片为质量标准，制片过程严格按照规定步骤，切片完整，细胞结构清晰，无胞内胞外冰晶。另外，从理论上讲，肺泡只要恢复到扩张状态，肺泡腔内有无肿瘤细胞侵袭一目了然。针对新鲜肺泡容易塌陷，研究人员提出了肺泡充气法来解决这一难题，此法能够达到扩张肺泡、减少干扰因素的目的，但因实际操作存在困难，还未得到广泛应用[14-15]。第三，提升病理医生的专业水平也是提高准确率的关键。遇到疑难病例时，尽可能取可疑部位制片，看片时把握原则综合分析，也可通过多人共览或者远程会诊降低误读。同时病理医生应勤于与手术医生沟通，减少不必要的误会。
综上所述，冰冻切片在规范操作下，对肺腺癌的良恶性诊断参考性较高，对手术方式具有指导意义，但是对肺腺癌的分类诊断结果存在一定的不符合率。现更应探索的是如何减少干扰冰冻切片诊断的因素，改进冰冻切片制作的方法，提高肺腺癌分类诊断的一致性。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
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