王柳璎，郭焕佳，姬生国
（广东药科大学中药学院，广东 广州 510000）
铁皮石斛来源于兰科石斛属铁皮石斛Dendrobium officinaleKimura et Migo.的干燥茎，具有益胃生津、滋阴清热作用［1］，分布于我国安徽、浙江、云南等地［2］。2020 年版《中国药典》 规定铁皮石斛的质量评价指标为多糖和甘露糖，其中多糖含量不得少于25%，甘露糖含量为13%～38%。铁皮石斛多糖具有抗肿瘤［3-4］、降血压［5］、降血糖［6］、降血脂［7］作用，而甘露糖是铁皮石斛多糖组成的主要单糖，对肿瘤、糖尿病、肥胖病都具有治疗作用［8-9］。随着人工栽培技术的成熟，铁皮石斛的种植面积开始扩大，不同产区栽培的铁皮石斛质量存在差异。目前采用传统经验鉴别或建立药材指纹图谱等方法对铁皮石斛质量进行评价，不够全面［10］。灰色关联分析是多种因素统计分析的一类方法，它是以各因素的样本数据为依据，用灰色关联度来衡量各因素间关联性大小［11］。本研究采用熵权法和灰色关联度法相结合的质量评价模型，以铁皮石斛多糖、甘露糖的含量、水分、总灰分和醇溶性浸出物作为评价指标进行研究。
1120 型高效液相色谱仪、BIY211b 万分之一电子天平、AY120 十万分之一电子天平（日本岛津公司）；
UV1102 型紫外可见分光光度计（上海天美股份有限公司）；
DELTA D150 型超声清洗器（上海旦鼎国际贸易有限公司）。
20 批铁皮石斛样品为2020 年7 月至8 月期间采自广东省、湖南省、四川省等栽培基地，详见表1，经广东农科院环艺所王再花副研究员鉴定为兰科石斛属植物铁皮石斛Dendrobium officinaleKimura et Migo。除去铁皮石斛叶，茎经105 ℃杀青15 min，60 ℃干燥后粉碎，过50 目筛，保存在自封袋中，置于干燥器中备用。
表1 样品信息Tab.1 Information of samples
无水葡萄糖（批号110833-202005）购于中国食品药品检定研究院；
甘露糖（批号140651-202002）购于中国药品生物制品检定所。甲酸、乙腈、乙酸铵为色谱纯；
其他试剂均为分析纯；
水为重蒸水。
2.1 多糖含量测定 精密称取无水葡萄糖0.100 0 g，用水溶解并定容至100 mL。取10 mL 溶液至100 mL量瓶，用水稀释至刻度，制成质量浓度为100 μg／mL 的对照品溶液。
精密称取样品0.300 0 g，加入200 mL 水，加热回流提取2 h，放冷，提取液转移至250 mL 量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过。精密量取2 mL 续滤液，置于15 mL 离心管中，精密加入无水乙醇10 mL，充分摇匀，置于4 ℃冰箱中冷藏1 h，离心20 min，弃去上清液，沉淀物用80% 乙醇洗涤2次，每次8 mL，离心，沉淀物加水溶解后转移至10 mL 量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
精密量取多糖对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL，置于10.0 mL 具塞试管中，加蒸馏水至1.0 mL，精密加入1 mL 5%苯酚溶液，摇匀，加入浓硫酸5.0 mL，于95 ℃水浴加热20 min。以1.0 mL 蒸馏水作为空白对照，于488 nm 波长处测定，以质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y）进行回归，得回归方程为Y＝ 0.008 737X＋0.005 2，r＝0.999 6。结果表明多糖在10～80 μg／mL范围内线性关系良好。
精密量取供试品溶液0.4 mL 置于10 mL 具塞玻璃试管中，加水至1.0 mL 后测定。
2.2 甘露糖含量测定 色谱条件为ODS-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；
流动相乙腈-0.02 mol／L乙酸铵（20∶80），等度洗脱；
检测波长250 nm；
体积流量1 mL／min；
柱温40 ℃；
进样量5 μL。
精密称取10 mg 甘露糖，置于100 mL 量瓶中，用水溶解并定容，制成质量浓度为100 μg／mL 的甘露糖对照品溶液。
精密称取样品粉末0.120 0 g，置于索氏提取器中，加入25 mL 80% 乙醇，加热回流提取4 h，弃去乙醇，将粉末取出挥干溶剂，置于具塞锥形瓶中，加入100 mL 水，加热煎煮1 h，放冷，用水补足至100 mL，离心，吸取上清液1 mL 置于具塞玻璃管中，加入0.5 mL 3.0 mol／L 盐酸，封口，混匀，置于沸水浴中水解1 h，放冷，用3.0 mol／L氢氧化钠调节pH 至中性。吸取400 μL，加入0.5 mol／L 1-苯基-3-甲基-5 吡唑啉酮甲醇溶液和0.3 mol／L 氢氧化钠溶液各400 μL，充分混匀，70 ℃水浴反应100 min，放冷，加入500 μL 0.3 mol／L盐酸，混匀。用三氯甲烷洗涤3 次，弃去三氯甲烷层，水层离心后吸取其上清液，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
精密吸取对照品溶液 25.000、10.000、2.500、1.250、0.625、0.500、0.250、0.150 mL，分别置于100 mL 量瓶中定容，测定甘露糖的峰面积，以对照品溶液质量浓度为纵坐标（X），峰面积为横坐标（Y）进行回归，得回归方程为Y＝9 798.398 9X＋1.105 1，r＝0.999 9，在0.15～25 μg／mL 范围内线性关系良好，色谱图见图1，结果见表2。
图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents
2.3 指标成分的测定 参照2020 年版《中国药典》 通则0832 水分测定法中的第二法“烘干法”、通则2302 灰分测定法中的总灰分测定法及通则2201 项下醇溶性浸出物测定法中的热浸法对铁皮石斛中水分、总灰分、醇溶性浸出物进行含量测定，结果均符合药典规定，见表2。
表2 各成分含量测定结果Tab.2 Results of content determination of various constituents
2.4 熵权法计算权重 设有n个样品，每个样品有m项评价指标，由此组成单元序列｛Xij｝（i＝1、2、3……n；
j＝1、2、3……m；
n为20，m为5）［12-13］。
2.4.2 各指标的信息熵 计算各个指标的信息熵Ej，公式为式中Ej为样品第j个指标的信息熵，若Pij＝0，则定义ln（Pij）＝0。
2.4.3 确定各指标权重 确定各指标的信息熵后，计算各指标的权重（Wj），公式为Wj ＝。结果见表3。
表3 信息熵及权重Tab.3 Information entropies and weights
2.5 灰色关联度法计算各指标相对关联度 设有n个样品，每个样品有m项评价指标，由此组成单元序列 ｛Xik｝（i＝1、2、3……n；
k＝ 1、2、3……m；
n为20，m为5），从质量评价的角度出发，水分和总灰分越低越好，多糖和甘露糖含量越高越好，对水分和总灰分两个指标的数据进行倒数转换［14］，评价指标统一后，将n个样品各项对应指标的最大值｛Xsk｝ 计为最优参考序列，n个样品各项对应指标的最小值｛Xtk｝ 计为最差参考序列。
2.5.2 关联系数计算 采用相应公式计算相对于最优参考序列｛Xsk｝ 和最差参考序列｛Xtk｝的关联系数［15］，，式中Δmin＝min｜Yik－Ysk｜；
Δmax＝max｜Yik－Ysk｜；
i＝1，2，3，…，n；
k＝1，2，3，…，m；
ρ称为分辨系数，此次取值为计算获得的各项指标的权重。结果见表4。
表4 各评价单元的关联系数Tab.4 Correlation coefficients for each evaluation unit
2.5.3 关联度计算 分别采用相应公式计算相对于最优参考序列｛Xsk｝ 和最差参考序列｛Xtk｝的关联度，
2.5.4 相对关联度的计算 按公式计算各评价单元的相对关联度，，式中i ＝1，2……n。
根据相对关联度的大小对评价单元序列进行排序，最终得到优劣评价结果。结合熵权法结果，各样品的相对关联度结果见表5。
表5 不同批次铁皮石斛相对关联度Tab.5 Relative correlation degrees of different batches of D.officinale
2.5.5 铁皮石斛的质量排序 对铁皮石斛多糖、甘露糖含量、水分、总灰分及醇溶性浸出物结果进行排序［16］，并使用灰色关联度法及熵权法结合灰色关联度法对20 批不同产地铁皮石斛进行质量排序，结果见表6。
表6 不同批次铁皮石斛质量排序Tab.6 Quality ranking for different batches of D.officinale
本研究构建熵权法结合灰色关联度法评价铁皮石斛质量模型，结果表明不同批次的铁皮石斛药材样品之间的相对关联度在0.228 2～0.496 0，说明不同产地之间存在质量差异，其中S1～S10 样品采集于广东省广州市栽培基地，各样品之间最小相对关联度为0.244 7，最高相对关联度为0.373 4。结果表明，样品采集于相同产地，但由于栽培环境、培植方法及养护方法等的不同，对铁皮石斛药材的质量会造成一定影响。
对样品排序及以灰色关联度法和以熵权结合灰色关联度法进行分析，样品S3 中总灰分及甘露糖含量均排第一，其在灰色关联度分析及综合分析评价中均排在第六；
样品S12 中水分含量排第一，其在灰色关联度分析及综合分析评价中均排在第二十；
样品S13 中多糖含量排第一，其在灰色关联度分析及综合分析评价中均排在第四；
样品S16 在灰色关联度分析及综合分析评价中均排第一。水分和总灰分的含量越高其质量越差，相反醇溶性浸出物、多糖和甘露糖含量越高其质量越优。但是灰色关联度法分析结果和熵权结合灰色关联度法分析的综合评价排序不一致，是因为灰色关联度法中各指标的ρ一直采用的是经验值0.5，即各指标权重相同，无法体现各个指标对整体质量的影响程度，在质量评价上并不能做到客观全面［17-18］。结合熵权法以后，以熵值来判断某个指标的离散程度，信息熵值越小，指标的离散程度就越大，则该指标对综合评价的影响（即权重）就越大［19］。经熵权法获得铁皮石斛中水分、灰分、浸出物、多糖、甘露糖含量的熵值分别为0.825 9、0.842 7、0.723 7、0.766 9、0.796 5。多糖及甘露糖含量的熵值较小，说明这2 种指标的含量对药材质量影响的权重最大。
本研究以水分、灰分、浸出物、多糖、甘露糖含量为指标，通过熵权结合灰色关联度法对铁皮石斛药材质量进行综合评价分析，相对于单一指标的评价较为科学，为建立科学、可靠的铁皮石斛药材质量评价体系提供了参考。
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