杨灿灿， 吴诗璟， 张 峒， 张元兴， 刘 琴,
（1. 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237；
2. 上海海洋动物疫苗工程技术研究中心，上海 200237）
猪流行性腹泻病毒 (Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV) 能感染各个年龄的猪，使得感染猪呕吐、腹泻、脱水、厌食等，引发哺乳仔猪高达近100%的死亡率，给世界各国的养猪产业带来严重的经济损失。20 世纪八九十年代，中国已有猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea, PED) 疫情的发生[1]。PED的零星出现，呈现出地方性流行的特点。2010 年以来，中国暴发了大规模的PED 疫情，给中国的养猪产业造成巨大的损失，因此亟需有效疫苗防控PED 的暴发[2]。
PEDV 属于α-冠状病毒属，形状像日冕，呈多形性，平均直径约110 nm，在电子显微镜下可以看到病毒颗粒边缘有棒状突起，突起长约20 nm[3]。PEDV是单股正链RNA 包膜病毒，基因组大小约28 kb，至少有7 个开放阅读框 (Open Reading Frame, ORF)。ORF分别编码非结构蛋白复制酶聚蛋白1a 和1b、辅助蛋白ORF3 以及结构蛋白纤突 (Spike, S) 蛋白、包膜(Envelope, E) 蛋白、膜 (Membrane, M) 蛋白和核衣壳(Nucleocapsid, N) 蛋白[4-7]。各个结构蛋白以及基因组相互作用构成PEDV 颗粒。PEDV 的抗原表位区域主要集中在S 蛋白上，S 蛋白包括S1 (1～789 aa)和S2 (790～1 383 aa) 两部分，其中COE (499～638 aa)、S1D (636～789 aa) 和C 末端 (1 371～1 377 aa) 是抗原中和表位区域[8-13]。此外，M 蛋白的M3 区域 (160～226 aa)也具有一定抗原活性[14]。这些抗原区域均可以作为开发亚单位疫苗的靶点。
自PED 暴发以来，中国、韩国、日本和美国等相继开发不同技术路线的疫苗以抵抗PEDV 的感染。目前PEDV 的疫苗研究主要集中在传统灭活疫苗、减毒疫苗以及新型核酸疫苗、亚单位疫苗和病毒样颗粒 (Virus-Like Particles, VLPs) 疫苗。亚单位疫苗凭借着抗原成分明确、不包含可能引起机体不良反应的冗余抗原部位、没有复制感染能力、适用于免疫力低下的群体等优势，受到疫苗研究者的广泛关注，是疫苗开发的一个重要方向。以S1 蛋白或S1蛋白的COE 区域为抗原，已经设计了多种亚单位疫苗，但至今没有上市的PEDV 亚单位疫苗[15-16]。这可能是因为COE 蛋白表位过于单一，S1 蛋白有诸多非抗原表位区域，在PEDV 亚单位疫苗设计中，COE 和S1蛋白可能没有表现出最好的免疫原性。
利用大肠杆菌、哺乳动物细胞、酵母细胞或杆状病毒载体表达系统 (Baculovirus Expression Vector Systems, BEVS) 表达PEDV 的S1 或者COE 蛋白已有成功先例[17-19]。用大肠杆菌表达抗原蛋白，可在短时间获得高产量目标蛋白，但在大肠杆菌中表达的抗原蛋白不能进行正确折叠和翻译后修饰，不利于保持目标蛋白的抗原活性。在哺乳动物细胞中，抗原蛋白能进行正确折叠和翻译后修饰，但哺乳动物细胞培养工艺复杂，成本高。BEVS 或酵母细胞是表达抗原蛋白的一个较佳表达系统，恰当的折叠和翻译后修饰有利于目的蛋白接近天然蛋白，并且昆虫细胞或毕赤酵母可大规模悬浮培养，有利于蛋白的大量生产。
本研究致力于开发安全、高效的PEDV 亚单位疫苗，实验选择了不同于S1 和COE 蛋白的亚单位，将PEDV 的诸多优势抗原表位连接起来组成串联表位EC，期望提高PEDV 亚单位疫苗的免疫原性。将EC 作为抗原蛋白，组装成杆状病毒载体表达系统，导入昆虫细胞系Sf9 表达目标蛋白；
利用镍柱亲和层析纯化目标蛋白，以收获纯度较高的目标蛋白；
利用小鼠实验检测串联表位EC 亚单位疫苗免疫效果，考察其作为PEDV 候选疫苗的潜力。
1.1 主要材料和试剂
质粒pFastBac1、大肠杆菌DH5α和DH10Bac 株、昆虫细胞Sf9 均为本实验室保存。无缝克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司，质粒小抽试剂盒和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液购自天根生化科技 (北京) 有限公司，质粒大抽试剂盒购自Macherey-Nagel 公 司，Cellfectin II 转 染 试 剂 购自Thermo Fisher Scientific 公司，昆虫细胞培养基购自壹生科 (深圳) 有限公司，His 一抗 (HRP) 和羊抗鼠IgG 抗体 (HRP) 购自华安生物技术有限公司，小鼠干扰素-γ(Interferon-γ, IFN-γ) ELISA 试剂盒和小鼠肿瘤坏死因子-α(Tumour Necrosis Factor-α, TNF-α) ELISA试剂盒购自欣博盛生物技术有限公司，氢氧化铝凝胶购自Invivogen 公司。BALB/c 小鼠 (雌性、4～6 周龄) 购自上海杰思捷实验动物有限公司。
1.2 串联表位设计与构建
参考NCBI 登录的PEDV 的S 蛋白和M 蛋白氨基酸序列 (GenBank: AF353511.1)，根据昆虫细胞表达系统，优化合成相应基因序列。以signal-F、signal-R、E1-F、E1-R、E1-R1、E2-F、E2-R、E4-F、E4-R、S1-R、P-EC-F、P-E1-F、P-S1-F 和P-EC-R 为引物 (表1)、以S 基因、M 基因和pFastBac1 质粒为模板，通过PCR 分别获得S 蛋白的分泌信号肽区域、COE 区域(E1)、S1D 区域 (E2)、C 端区域 (E3)、S1 区域以及M 蛋白的M3 区域 (E4) 基因序列和线性化pFastBac1载体。用Linker (GGGGS) 将E1、E2、E3 和E4 序列串联起来，得到串联表位EC。在EC 的N端加上S 蛋白分泌信号肽，C端加上6× His 标签。用文献报道的COE 和S1 亚单位作为对照[17,20-21]，先用无缝克隆试剂盒分别将EC、COE 和S1 基因序列与pFastBac1 载体连接起来，再将连接产物转化为大肠杆菌DH5α 感受态细胞，并用含有氨苄青霉素的LB 平板筛选。筛选获得阳性克隆后对其基因测序，再从测序无误的阳性克隆中提取重组pFastBac1-EC、pFastBac1-COE 和pFastBac1-S1 质粒。分别将重组质粒转化为大肠杆菌DH10Bac 感受态细胞，用含有卡那霉素、氯霉素、四环素、IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷) 和X-gal 的LB(Luria-Bertani) 平板筛选。筛选获得阳性克隆后对其基因测序，再从测序无误的阳性克隆中提取重组MultiBac-EC、MultiBac-COE 和MultiBac-S1 质粒。取对数生长期、存活率高于90% 的Sf9 细胞接种于六孔板，接种密度每毫升含1×106个细胞，每孔2 mL。利用Cellfectin II 转染试剂分别将MultiBac-EC、MultiBac-COE 和MultiBac-S1 重组质粒转染Sf9 细胞。将转染后的Sf9 细胞在27 ℃培养箱中静置培养4 d，收获P1 代重组杆状病毒。以感染复数 (Multiple of Infection, MOI) 为0.1、用P1 病毒感染Sf9 细胞。将感染的Sf9 细胞在27 ℃培养箱中静置培养4 d，收获较高滴度的P2 代重组杆状病毒，再依次收获更高滴度的P3 代重组杆状病毒。用蛋白印迹 (Western Blot, WB) 法分别检测P3 代重组杆状病毒的Sf9 细胞培养液上清、Sf9 细胞裂解液上清和Sf9 细胞裂解液沉淀，用His 一抗 (HRP)鉴定EC 蛋白、COE 蛋白和S1 蛋白的表达情况。
表1 引物信息Table1 Primers information
1.3 EC 蛋白、COE 蛋白和S1 蛋白的生产与纯化
为了生产EC 蛋白，将对数生长期、存活率高于90% 的Sf9 细胞按照每毫升7× 105个细胞的密度接种于1 L 摇瓶中，每瓶400 mL，扩培20 瓶。在27 ℃、140 r/min 培养24 h，待细胞密度长至每毫升1.5×106个细胞左右时，以MOI 为0.5 加入P3 代病毒。当细胞存活率降至30% 左右时收取样品，在1 000×g、4 ℃下离心10 min，收集离心上清，在10 000×g、4 ℃下再次离心30 min，收集离心上清。先用0.45 μm滤膜过滤，再用截留分子量10 kDa 的膜包超滤浓缩，再次用0.45 μm 滤膜过滤浓缩样品。
采用镍柱亲和层析法纯化EC 蛋白。相关缓冲液配方为：(1)平衡液：20 mmol/L Tris-HCl + 100 mmol/L NaCl + 2 mmol/L 咪唑 (pH 8.4)；
(2)洗脱液：20 mmol/L Tris-HCl + 100 mmol/L NaCl +X(X分别为15，50，100，500 mmol/L)咪唑 (pH 8.4)。镍柱亲和层析步骤如下：先以115 cm/h 的流速用去离子水洗5 个柱体积，再以同样流速用平衡液平衡柱子 (5 个柱体积)，然后以75 cm/h 流速上样，收集流穿样品；
上样完成后以115 cm/h 流速用平衡液冲洗柱子 (5 个柱体积)，再以115 cm/h 的流速依次用咪唑浓度由低到高的洗脱液逐步洗脱目标蛋白和杂蛋白，收集洗脱样品。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)检测纯化效果。
同样，用携带COE 基因的重组杆状病毒感染Sf9 细胞 (MOI 为0.5) 生产COE 蛋白；
用携带S1 基因的重组杆状病毒感染Sf9 细胞 (MOI 为5) 生产S1 蛋白。纯化COE 蛋白时，相关缓冲液配方为：(1)平衡液：20 mmol/L Tris-HCl + 100 mmol/L NaCl +2 mmol/L 咪唑溶液 (pH 8.4)；
(2) 洗脱液：20 mmol/L Tris-HCl + 100 mmol/L NaCl +X(X分别为10，50，100，500 mmol/L)咪唑 (pH 8.4)。纯化S1 蛋白时，相关缓冲液配方为：(1)平衡液：20 mmol/L PB + 150 mmol/L NaCl + 2 mmol/L 咪 唑 溶 液 (pH 7.4)；
(2) 洗 脱 液：20 mmol/L PB + 150 mmol/L NaCl +X(X分别为10，15，50，100，500 mmol/L)咪唑 (pH 7.4)。其余步骤同EC蛋白的生产与纯化过程。
1.4 EC、COE 和S1 亚单位疫苗免疫原性评价
将BALB/c 小鼠分为EC 亚单位疫苗免疫组 (EC +AL)、COE 亚单位疫苗免疫组 (COE + AL)、S1 亚单位疫苗免疫组 (S1 + AL) 和PBS 对照组 (PBS)，每组各免疫10 只。分别将EC、COE 和S1 蛋白分别与铝胶佐剂等体积混合制备成疫苗，再分别将各组疫苗和PBS 皮下注射到BALB/c 小鼠体内。首次免疫剂量为每剂75 μg，首次免疫后两周进行二次免疫，二次免疫剂量为每剂50 μg。分别在二次免疫后7 d 和14 d摘除小鼠眼球取血，将其放入血液室温静置1 h，再放置4 ℃冰箱过夜，在3 000 r/min、4 ℃离心15 min。用移液枪吸出上层血清到新的EP 管中，再次在3 000 r/min、4 ℃离心15 min。将上层血清分装到PCR 管中，每管10 μL，保存在-20 ℃冰箱备用。用酶联免疫吸附测定 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)法分别检测血清中的IgG 抗体、IFN-γ和TNF-α。
检测IgG 抗体时，用纯化的COE、EC 和S1 蛋白作为包被抗原，3 种包被抗原等质量比混合，包被抗原的总质量浓度为6 μg/mL。用PBS 稀释抗原，将稀释混合好的抗原加入酶标板中 (每孔100 μL)，再将酶标板放置4 ℃冰箱孵育过夜。弃去酶标板中的液体，每孔加入300 μL PBST 洗涤，静置30 s 后弃去PBST，在吸水纸上拍干酶标板，如此重复洗涤5 次。加200 μL、10 g/L BSA 到酶标板各个孔中，在37 ℃恒温箱孵育2 h，再次用PBST 洗涤。加100 μL、10 g/L BSA 稀释1 600 倍的血清到酶标板各个孔中，在37 ℃恒温箱静置孵育1 h，用PBST 洗涤后，加100 μL、10 g/L BSA 稀释5 000 倍的羊抗鼠IgG 抗体 (HRP)到酶标板各个孔中，37 ℃恒温箱静置孵育1 h，再次洗涤。加100 μL TMB 底物溶液到酶标板各个孔中，室温避光孵育10 min。加50 μL、2 mol/L H2SO4溶液到酶标板各个孔中以终止反应，尽快用酶标仪在OD450处检测各个孔的吸光度值。
2.1 重组杆状病毒鉴定
将筛选获得的白斑进行PCR 验证，结果如图1所示。PCR 获得EC、COE、S1 片段的理论大小分别约3 500、2 700、4 500 bp，各个片段都符合理论大小。将PCR 反应原液测序，并将测序正确的菌株保种。
图1 携带EC、COE、S1 序列的重组杆状病毒菌落验证Fig.1 Validation of recombinant baculovirus colonies born with EC, COE, S1 sequences
2.2 EC、COE、S1 蛋白表达
EC、COE、S1 蛋白C 端均带有His 标签，可用His抗体检测目标蛋白。采用WB 法分别检测P3 代病毒的Sf9 细胞培养液上清、Sf9 细胞裂解液上清和Sf9 细胞裂解液沉淀，结果如图2 所示。本实验预测COE、EC 和S1 蛋白大小分别为19、44 kDa 和81 kDa，同时COE、EC、S1 蛋白都可在培养液上清里检测到，说明这3 种蛋白能在Sf9 细胞中可溶性表达，并分泌到细胞外。
图2 Western Blot 检测COE (a)、EC (b) 和S1 (c) 蛋白在昆虫细胞系Sf9 中表达Fig.2 Expressions of the COE (a), EC (b) and S1 (c) proteins in insect cell line Sf9 detected by Western Blot
2.3 EC、COE 和S1 蛋白的纯化
EC、COE 和S1 蛋白C 端均带有His 标签，采用镍柱亲和层析纯化各个蛋白，用SDS-PAGE 检测不同条件下洗脱的样品,结果见图3。由图可见，在本文的实验条件下，EC、COE 和S1 蛋白在镍柱上的亲和结合效果较佳，没有检测到目标蛋白流穿；
大部分杂蛋白流穿，与目标蛋白分离。20 mmol/L Tris-HCl +100 mmol/L NaCl +50 mmol/L 咪 唑 洗 脱 液 (pH 8.4)、20 mmol/L Tris-HCl + 100 mmol/L NaCl + 10 mmol/L咪唑洗脱液 (pH 8.4) 和20 mmol/L PB + 150 mmol/L NaCl + 50 mmol/L 咪唑 (100 mmol/L) 咪唑洗脱液 (pH 7.4) 分别是洗脱EC、COE、S1 蛋白的最优条件，可以洗脱大部分目标蛋白。
图3 SDS-PAGE 检测镍柱亲和层析纯化的EC (a)、COE (b) 和S1 (c) 蛋白Fig.3 SDS-PAGE determinations of EC (a), COE (b) and S1 (c) proteins purified with Ni affinity chromatography column
2.4 亚单位疫苗免疫效果
为了评价EC 亚单位疫苗的免疫原性，我们将EC 免疫组亚单位疫苗 (EC + AL)、COE 免疫组亚单位疫苗 (COE + AL)、S1 免疫组亚单位疫苗 (S1 + AL)和免疫对照组PBS 分别皮下注射到BALB/c 小鼠颈背部，首次免疫后两周进行二次免疫。分别在二次免疫后的7 d 和14 d 摘除小鼠眼球取血，用ELISA法检测血清中的IgG 抗体、IFN-γ和TNF-α。
采用间接ELISA 法检测二次免疫后第14 d 的小鼠血清IgG 抗体水平。抗原包被质量浓度为6 μg/mL，血清稀释比例为1∶1 600。图4(a)结果表明，与PBS对照组相比，各个实验组中免疫小鼠血清中的IgG抗体均有显著提升 (P＜ 0.001)，COE + AL 组免疫小鼠血清IgG 抗体水平与S1 + AL 组没有明显差异，串联表位亚单位疫苗EC + AL 组免疫小鼠血清IgG 抗体水平显著高于其余各组 (P＜ 0.01)，比COE + AL组和S1 + AL 组分别提升了43% 和52%。
图4 ELISA 检测两次免疫EC、COE 或S1 亚单位疫苗小鼠血清IgG (a)、IFN-γ (b) 和TNF-α (c) 水平Fig.4 ELISA determination of serum IgG (a), IFN-γ (b) and TNF-α (c) levels of mouse vaccinated with EC, COE or S1 subunit vaccine twice
采用双抗夹心ELISA 法检测二次免疫后第7 d的小鼠血清IFN-γ(图4 (b)) 和TNF-α水平 (图4 (c))。结果表明，与PBS 对照组相比，各个实验组中免疫小鼠血清IFN-γ和TNF-α均有一定提升，COE+AL 组免疫小鼠血清IFN-γ、TNF-α水平与S1 + AL 组接近，串联表位亚单位疫苗EC+AL 组免疫小鼠血清IFN-γ、TNF-α水平高于其余各组，其中EC+AL 组的IFNγ水平比COE+AL 组和S1+AL 组分别提高了61%和53%，TNF-α水平比COE+AL 组和S1+AL 组分别提升了84%和65%。
本文将S 蛋白的COE 区域、S1D 区域、C 端区域以及M 蛋白的M3 区域通过Linker 串联起来，设计了串联表位EC。将EC 和文献报道的COE 和S1 基因片段分别插入杆状病毒基因组，EC、COE、S1 蛋白在BEVS 中实现了分泌表达。在不同的纯化条件下，分别获得了较高纯度的EC、COE、S1 蛋白。EC + AL 组、COE + AL 组和S1 + AL 组亚单位疫苗以及PBS 对照组分别免疫BALB/c 小鼠后，EC +AL 组表现出了更强的免疫原性。EC + AL 组亚单位疫苗激发小鼠产生更高水平的特异性抗体IgG 以及免疫相关细胞因子IFN-γ和TNF-α。这说明串联表位EC 能更好地激发小鼠的体液免疫和细胞免疫应答，具有作为PEDV 亚单位疫苗的潜力。
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