陈开意，何文妮，邵 波
（浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江 杭州 310011）
近年来，防晒化妆品的使用日益增长，这使得防晒剂中的主要成分有机紫外防晒剂逐渐成为了一种新型环境污染物，其环境污染问题在各国普遍存在[1]。有健康研究表明，部分有机紫外防晒剂对内分泌系统有干扰作用，并且会危害人体和生物体的生殖系统和遗传系统，不利于胚胎的发育以及出生后的发育，非但如此，还会对人类身体健康造成潜在危害并对周边生态环境造成污染[2]305。
因此，有机紫外防晒剂被大家认定为一种新的内分泌干扰物质[3-4]。
有机紫外防晒剂是指能够吸收长波紫外线和中波紫外线的一类有机化合物，这些紫外线会晒黑甚至晒伤我们的皮肤[5]。
紫外线防晒剂的分子都包含可以吸收波长小于400 nm 的紫外线的发色团，发色团为了实现紫外线屏蔽功能通过吸收紫外线并将其转换为热能、化学能或者其他非紫外线能。
紫外防晒剂的品种较多，在各种类型的有机紫外防晒剂中，二苯甲酮类防晒剂拥有良好的性能，价格便宜且应用范围广，在紫外防晒剂中占据着重要的地位[6]。
由于有机紫外防晒剂的广泛使用，因此在使用过程中会通过各种方式进入环境。
另外，大多数有机紫外防晒剂都可以溶解在非极性溶剂中，残留在环境中周期长，不易被降解。
有机紫外防晒剂有2 种方式进入环境，分为直接方式和间接方式。
其中，直接方式包括通过废水排放防晒剂，将有机紫外防晒剂带入水生生态系统中；
而间接方式包括通过每天洗涤、游泳和沐浴等途径带入水中。它们可以渗入皮肤或通过食物链进入人类身体。
Janjua 等人经过大量研究发现有机紫外防晒剂二苯酮-3（BP-3）和4- 甲基苄亚甲基樟脑可以通过皮肤进入人体内，并计算出了人体血浆中含有的最大质量浓度分别为0.238 mg/L 和0.018 mg/L[7]。
有研究表明，有机紫外防晒剂有较高毒性，而且有机紫外防晒剂通常都含有不饱和链和苯环，导致其残留在环境中难以降解，容易对环境造成持续影响。目前，有机紫外防晒剂存在于多种环境介质中，例如大气生态系统、土壤生态系统和水生生态系统等等。
Vila 等人经过检测得出二苯酮-4（BP-4）容易对藻类造成风险，而BP-3 和甲氧基肉桂酸乙基己酯（EHMC）则更容易对鱼类造成危害[8]。
另外，人体内也被不断检测出存在有机紫外防晒剂，证实了有机紫外防晒剂能通过食物链的富集最终进入人体和动植物体内。
已有报道指出，有机紫外防晒剂对人体和动物体的内分泌系统、生殖发育系统、遗传系统和神经系统等都有不同程度的不良影响。
通过对BP-4 作用于牛血清白蛋白（BSA）时的作用机理的研究，可以了解在生物体内BSA 与BP-4 之间的结合作用，而且对于现在的环境状况来说，有机紫外防晒剂与BSA 之间的相互作用的结果可以为环境污染的治理提供参考。
血清白蛋白是一种常用的载体蛋白，它在人体内的血液循环系统中起到贮存和运输物质的重要作用。将BSA 作为研究对象，探究其与内源或外源性物质相互联结而发生作用后的影响机理已成为生命科学、环境科学和临床医学研究的重要方向。BSA 是牛血浆中含量最丰富的载体蛋白，它具备广泛的结合能力，同时具有很强的内源性荧光。
外源性化合物与蛋白质分子相互感化会导致蛋白质的内源性荧光强度下降，这就说明其发生荧光猝灭[9]。
目前荧光光谱法已成为研究某些物质作用于血清白蛋白时的分子机理和作用程度的有效方法。
敖俊杰等人通过荧光分光光度法研究了3 种常见的有机紫外防晒剂与BSA 的相互作用的作用机理[2]308。
本实验通过研究BP-4 与BSA 相互作用来间接验证其对人体的影响。
本文利用荧光分光光度法来探求BP-4 与BSA 相互作用的机理，了解二者相互作用的猝灭机理。
根据测定的数据来绘制荧光光谱图，分析结果可知BP-4 与BSA 相互作用的荧光猝灭规律以及相对应的猝灭常数，BP-4 与BSA 互相作用的作用力类型可以通过计算分析热力学参数来确定。这有利于让我们了解其在人体内的分布情况和运输过程，对于我们认识有机紫外防晒剂的毒性有着非常重大的意义，同时这也有助于推动关于有机紫外防晒剂的生态毒性的研究。
1.1 实验设备与材料
1.1.1 实验设备
Rf-5301pc 荧光分光光度计，日本日立公司；
al-204 型电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司；
bcd-216zdjJ 型冰箱，青岛海尔有限公司；
Dk-8D 型数控超级恒温槽，上海森信实验仪器有限公司；
paoifio-t-2-20 型纯水机，山东博科科学仪器有限公司；
phsj-4F 型实验室pH 计，上海仪电科学有限公司；
玻璃棒、容量瓶（100 mL，250 mL）、移液管（1 mL，5 mL）、烧杯（100 mL），上海铂勒机电设备有限公司。
1.1.2 实验材料
BSA，BR 级，质量分数98%，上海如吉生物科技有限公司；
BP-4，BR 级，质量分数>99%，上海榕柏生物技术有限公司；
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris 化学药品），AR 级，质量分数>99%，天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.1.2.1 BSA 的性质
BSA 是一种乳白色的片状粉末。它的相对分子质量为104，血清蛋白是血液的主要成分，其相对分子质量是68 000，血清蛋白包含581 个氨基酸，其中带有的17 个二硫键是由35 个半胱氨酸组成，而游离巯基组成第34 个肽链，牛血清白蛋白能够和多种阴、阳离子以及小分子结构的物质结合在一起[10]。
血液中的白蛋白主要有以下几种作用，维持渗透压、缓冲pH、承担载体和营养作用。
在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到载体作用和生理和机械保护作用。
1.1.2.2 BP-4 的性质
BP-4 是一种奶白色至黄色的粉末，无气味。
分子式是C14H12O6S，相对分子质量是308.04，溶解度为0.65，是一种常见的有机紫外防晒剂，属于水溶性化学防晒剂。
图1 是其化学结构式。
图1 BP-4 化学结构式
1.2 实验方法
1.2.1 溶液配置
量浓度为1×10－5mol/L BSA 标准储备液体：用电子天平称取0.068 g 的BSA，用超纯水溶解在烧杯中，移入100 mL 的容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，摇匀，放置于温度为4 ℃冰箱中进行保存。
量浓度为1×10-4mol/L BP-4 标准溶液：用电子天平准确称取0.003 1 g 的BP-4，溶于少量超纯水中，移入100 mL 容量瓶中，用超纯水稀释至刻度并摇匀，放置于温度为4 ℃冰箱中进行保存。
量浓度为0.2 mol/ L Tris-HCl 缓冲溶液：准确称取24.228 g 的Tris 药品倒入1 L 的大烧杯中，溶于超纯水中，将超纯水加至约700 mL，用浓HCl 调节pH至7.40±0.05，然后移入容量瓶中，用1 000 mL 超纯水定容稀释，摇匀，放置于室温下进行保存。
1.2.2 荧光猝灭实验
在10 mL 比色管中分别加入2 mL Tris-HCl 缓冲液、5 mL 的BSA 标准储备溶液以及适量的BP-4标准溶液，用超纯水定容并摇匀，使BP-4 的最终量浓度分别为0、0.9×10-6、1.8×10-6、2.7×10-6、3.6×10-6、4.5×10-6、6.3×10-6、7.2×10-6和8.1×10-6mol/L。
将上述溶液置于恒温水槽中，水温分别调节为300、305和310 K，在恒温条件下作用0.5 h 至平衡后测定其荧光光谱。
将荧光分光光度计固定激发波长为285 nm，狭缝宽度设置为10 nm，然后测定在250～500 nm 范围区间内的发射光谱，将荧光强度最大时对应的发射波长记录下来[11]。
2.1 BP-4 与BSA 相互作用的猝灭机理
由于蛋白质大分子具有酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）等小分子结构，所以可以产生较强的内源性荧光。
当蛋白质分子与外源性化合物互相作用时可能会降低蛋白质的内源性荧光强度。300 K 时BP-4 与BSA 相互作用产生的荧光光谱图如图2 所示。
其中从B 到J 的药物量浓度分别为0、0.9×10-6、1.8×10-6、2.7×10-6、3.6×10-6、4.5×10-6、6.3×10-6、7.2×10-6和8.1×10-6mol/L。
图2 300 K 时BP-4 与BSA 相互作用产生的荧光光谱图
由图2 可见，向BSA 中加入BP-4 后，BSA 在340 nm 附近出现荧光峰值。
随着BP-4 浓度的不断升高，BSA 的荧光强度有规律地降低，这说明BP-4作用于BSA 时有荧光猝灭作用，引起此处内源性荧光有规律地猝灭。
在普遍情况下，我们将荧光猝灭的过程分为动态猝灭和静态猝灭2 种类型[12]。在动态猝灭过程中，荧光物质的激发态分子通过与猝灭剂分子的碰撞作用，以能量转移的机制或电荷转移的机制丧失其激发能而返回基态。而静态猝灭从实质上来说是因为荧光体和猝灭剂通过结合形成了基态复合物，这在微观层面上会影响蛋白质的二级构造，从宏观层面上影响其生理活性。可以通过双分子猝灭速率常数Kq来判断荧光猝灭类型， 温度会影响猝灭作用以及荧光光谱的变化。
随着温度的不断上升，由于有效碰撞的离子数不断增加引起电子迁移的过程加剧属于动态猝灭；
反之如果猝灭常数随温度的不断升高而下降，则属于静态猝灭。
这是由于复合物的稳定性随着温度的变化而变化。
为了更加深入地证实此猝灭过程的种类，先把它当作动态猝灭来处理，借助斯特恩-沃尔默方程[见式（1）]进行计算[13]：
其中，F0和F 分别是不存在BP-4 时的荧光强度和存在不同浓度BP-4 后的荧光强度；
Kq是双分子猝灭速率常数，单位为L/（mol·s）；
τ0是不存在猝灭剂时荧光分子平均寿命，单位为s，通常生物大分子的荧光寿命为10-8s；
[Q]为BP-4 的量浓度，mol/L；
KSV为动态猝灭常数。
以F0/F 对[Q]进行建模，可以得到线性回归方程，计算出猝灭速率常数，结果如表1 所示。
表1 BP-4 与BSA 在不同温度下相互作用的猝灭常数
根据表1 数据可知，猝灭常数随着温度的升高而减少，且Kq的数量级大大超过了生物大分子在水溶液中的最大扩散碰撞猝灭常数1 个数量级，这表明BP-4 与BSA 相互作用产生了不具有荧光性的复合物，该过程属于静态猝灭。
2.2 BP-4 在BSA 上的结合位点及结合模式分析
从2.1 的结果可知，BP-4 对BSA 的猝灭机理属于静态猝灭，因此BP-4 的浓度与荧光强度的关系就符合Lineweaver-Burk 双导数方程[14]，见公式（2）。
式中：n 是结合位点数；
Ka是结合常数，L/mol。
通过lg（[F0-F]/F）对lg[Q]进行拟合，得到线性回归方程，由此可以分别计算出在不同温度下BP-4与BSA 相互作用的结合常数、结合位点数，结果见表2。
由表2 数据可见，BP-4 与BSA 二者结合紧密，证明了二者之间剧烈的结合作用，且BP-4 与BSA 之间的结合位点数基本为1，则表明BP-4 与BSA 之间形成1 个结合位点。
表2 BP-4 与BSA 相互作用的结合常数、结合位点数以及相关系数
2.3 BP-4 与BSA 相互作用的热力学参数与结合力
一般来说，有机小分子与蛋白质等生物大分子相互作用时的作用力主要包括范德华力、疏水作用力和氢键结合力等[15-16]。
当温度变化范围不大时，可近似把焓变和熵变当做常数，根据范特霍夫方程[见公式（3）]来计算反应的焓变和熵变，再由公式（4）来计算反应的自由能变。
式 中，R 为 标 准 气 体 常 数：8.314 J/（mol·K）；
△H为反应焓变，单位为kJ/mol；
△S 为反应熵变，单位为J/（mol·K）；
T 为温度，单位为K；
ΔG 为反应的自由能变，单位为kJ/mol。
以结合常数的对数为纵坐标，温度的倒数为横坐标进行线性拟合，根据方程的截距和斜率分别计算得△H、△S 及△G 值，结果见表3。
从热力学基本关系式来看，在温度和压力一定的情况下，体系中的ΔG 决定了小分子物质与蛋白质的相互作用能否自发进行，当ΔG＜0 时，该反应可以自发进行。
Ross 等人研究并总结出判断生物大分子自身相互作用力性质以及生物大分子与小分子物质之间相互作用力的规律，通过比较反应发生前后热力学焓变ΔH 和熵变ΔS 的相对大小，可以判断分子间相互作用力类型：如果是典型的疏水作用力，则ΔH＞0，ΔS＞0；
如果是氢键和范德华力，则ΔH＜0，ΔS＜0；
如果是静电引力，则ΔH＜0，ΔS＞0[17]。
表3 BP-4 与BSA 相互作用的热力学参数
所得数据可知，ΔG＜0，表明BP-4 可与BSA 自发反应；
根据ΔH 和ΔS 判断，BP-4 主要通过氢键和范德华力与BSA 结合[18]。
根据分析上述实验数据，可以得出以下结论：
（1） BP-4 与BSA 相互作用使得其自身的荧光发生明显猝灭现象，且这种猝灭作用随BP-4 的浓度升高而增强，可得出该过程属于静态猝灭。
（2） BP-4 与BSA 之间的结合位点数为1 左右，表明二者之间存在一种类型的结合位点。
（3） 经过计算BP-4 与BSA 互相作用的热力学参数，可以知道二者的作用过程是自发进行的，并且BP-4与BSA 之间的相互作用力属于氢键和范德华力。
目前我国有机紫外防晒剂的污染问题日益严峻，人们也越来越重视对其毒理性质的研究。本实验表明BP-4 能在人体中通过BSA 进行转运和储存。
目前已有有机紫外防晒剂对水生动物鱼类的内分泌干扰的相关研究[19-20]。但是对于人体组织细胞的影响研究还很少，需要进一步深入探索，目前的研究尚不能解释有机紫外防晒剂和内分泌系统之间的干扰效应。
所以，在未来的研究内容中，我们应该更加进一步去研究有机紫外防晒剂产生的不同内分泌干扰效应的机理。
这样才能让我们更加完整科学地认识有机紫外防晒剂对不同生物包括人体健康的各种危害。
这不仅让我们进一步了解在平时日常生活中如何正确运用防晒剂这类个人护理用品，与此同时也可以为相关部门提供数据方便科学决策。
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