刘涛 曹建敏 郭存 陈刚 文利超 邓智超 郭永峰 李伟
摘 要：為探究优质烤烟核心亲本的烟叶质量特征差异，选取7个常用的育种亲本，对其烤后烟叶常规化学成分、致香物质及感官质量进行比较分析。结果表明，氯含量在不同品种中差异较大；
两糖比和钾氯比均在优质烤烟适宜范围；
氮碱比除NC82和大白筋599在适宜范围内外，其他品种整体偏高。类胡萝卜素降解产物、叶绿素降解产物、棕色化反应产物和其他类香气物质在红花大金元中含量最高，苯丙氨酸类降解产物和类西柏烷类降解产物在革新三号中含量最高。聚类分析将7个烤烟品种分为3类，G28、K326、小黄金1025、NC82和革新三号为一类，大白筋599和红花大金元各为一类。经因子分析和OPLS-DA分析后，筛选到17种差异代谢物，其中，β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯、反式-2，4-庚二烯醛、5，6-环氧紫罗兰酮在红花大金元中含量较高，巨豆三烯酮-1、巨豆三烯酮-2、巨豆三烯酮-3、巨豆三烯酮-4在NC82和红花大金元中含量均较高，2-吡咯甲醛在小黄金1025和革新三号中的含量较高，吡喃酮在小黄金1025中的含量较高，降茄二酮在革新三号中含量较高，茄酮在NC82、G28和革新三号中含量较高。这些差异组分主要是由遗传基础决定的，可为以后育种工作提供参考。
关键词：烤烟；
品种；
化学成分；
致香物质
中图分类号：S572.03 文献标识码：A 文章编号：1007-5119（2023）02-0074-09
Abstract：
In order to explore the differences in quality characteristics of toasted tobacco leaves of core parents of high-quality flue-cured tobacco， we selected 7 commonly used breeding parents， compared and analyzed the conventional chemical components， odorant substances and sensory quality of the toasted tobacco leaves. The results showed that the chlorine content varied greatly among different varieties; the ratio of two sugars and the potassium to chlorine ratio were all within the suitable range of high-quality flue-cured tobacco; the nitrogen-alkali ratio was higher in all varieties except NC82 and Dabaijin599， which were within the suitable range. The contents of carotenoid degradation products， chlorophyll degradation products， browning reaction products and other aroma substances were the highest in Honghuadajinyuan， and the contents of phenylalanine-like degradation products and cembrane-like degradation products were the highest in Gexin3. Based on cluster analysis we could divide the 7 flue-cured tobacco varieties into 3 categories：
G28， K326， Xiaohuangjin1025， NC82 and Gexin3 belonged to one category， and Dabaijin599 and Honghuadajinyuan belonged to two separate categories. After factor analysis and OPLS-DA analysis， 17 differential metabolites were identified， with the contents of β-Ionone， Dihydroactinolactone， 2，4-Heptadienal， （E，E）-1 and β-Ionone-5，6-epoxyde breing higher in Honghuadajinyuan， and the contents of Megastigmatrienone-1， Megastigmatrienone-2， Megastigmatrienone-3 and Megastigmatrienone-4 being higher in NC82 and Honghuadajinyuan， the content of 2-Formylpyrrole being higher in Xiaohuangjin1025 and Gexin3， the content of Pyranone being higher in Xiaohuangjin1025， the content of Norsoladione beinghigher in Gexin3， the content of Solanone being higher in NC82， G28 and Gexin3. The characteristics of aromatic substances in different varieties are different， which can provide guidance for aroma breeding.
Keywords：
flue-cured tobacco; cultivar; chemical component; aroma components
烟草是我国重要的经济作物，在国民经济发展中发挥着重要的作用。近年来，随着中式卷烟的发展，卷烟工业部门对烟叶的质量要求逐渐提高，烟叶的品质和香气质量越来越受到重视。研究表明， 化学成分是决定烟叶品质的内在因素，致香物质是烟叶香气品质形成的重要物质基础[1]；
香气质、香气量以及香型与烟叶中的致香物质成分密切相关，不同的成分彰显烟叶不同的品质特征[2]。烟叶生产
中，烤后烟叶的质量受多种因素影响，如品种、生长环境、栽培措施等。在生态环境和栽培措施相似的情况下，遗传因素起决定作用[3]。
目前，关于不同基因型烤烟化学成分和致香物质差异研究已有许多报道。张双双等[4]比较分析了云南省曲靖烟区K326、NC297、KRK26、云烟97和云烟87等5个烤烟品种的常规化学成分和中性致香物质，发现不同基因型烟叶的中性致香物质种类基本相同，但含量存在较大差异；
周芳芳等[5]对云南不同烟区K326、云烟87和红花大金元3个烤烟品种的致香物质成分进行了分析，发现3个品种致香物质含量的地域分布特征差异较大，同一地区内K326和云烟87致香物质含量的相似性高，均与红花大金元存在较大差异。以上研究采用的种质资源仅包含较少的育种常用的核心种质，难以满足烤烟香气育种的需求。此外，李晨营等[6]通过对四川、山东2个产区51份烤烟种质中致香物质的比较分析，初步明确了不同烟区致香物质的差异。但该研究侧重点在于两个烟叶产区之间的比较，对不同种质之间的差异分析较少。鉴于此，本研究选取了7个优质烤烟核心亲本，包括K326、NC82、G28、红花大金元、革新三号、小黄金1025和大白筋599，进行常规化学成分、致香物质及感官质量评价比较分析。K326、NC82和G28是国外引进的优良品种，具有优质、高产和抗病的特点[7-8]。有研究表明，以改良烟叶浓香型风格为育种目标时，红花大金元和革新3号是比较理想的亲本[9]。小黄金1025虽然高感黑胫病，但因其香气量较足，香气质好，是优质的烤烟育种材料。大白筋599已被证实含有与其他烤烟品种香气特性不同的关键致香物质赖百当二萜冷杉醇[10]。雖然这7个烤烟品种作为重要的种质资源已育出多个品种（系），如云烟85、云烟87、中烟100、中烟90、辽烟15号等[11-18]，但是在同样的生态条件下，7个品种的遗传基础对烤后烟叶质量的影响尚未见系统报道。因此，本研究在山东临沂烟区，对7个品种进行比较分析，明确不同香型烤烟品种中的主要致香物质种类、含量以及关键香气成分特征，对烤烟香气育种具有积极意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
烤烟品种K326、NC82、G28、红花大金元、革新三号、小黄金1025和大白筋599种质均由中国农业科学院烟草研究所烟草种质资源中期库提供。
1.2 试验方法
1.2.1 试验设计 2021年在山东临沂蒙阴县桃墟镇试验田进行试验，选择土壤肥力均一，且地势平坦的地块。采用随机区组设计，设置3个重复，每个小区3行共120株，行距1 m，株距0.5 m，设保护行。田间管理严格按照当地生产规范要求进行，所有小区农事操作相同。待中部叶达到适熟阶段，取各小区成熟度一致的中部叶并挂牌编号，在同一烤房按照产区标准烘烤工艺进行烘烤。取烤后C3F等级的烟叶，去除主脉后，烘干并粉碎，用于测定化学成分、致香物质，进行感官质量评价。
1.2.2 烟叶化学成分测定 分别参照烟草行业标准YC/T 159—2019、YC/T 160—2002、YCT 33—1996、YC/T 217—2007和YC/T 162—2011，测定烟叶水溶性糖（包括总糖和还原糖）、总植物碱、总氮、钾和钠含量。
1.2.3 烟叶致香物质测定 称取1.0 g烟末置于顶空瓶中，用微量注射器将乙酸苯乙酯（内标）滴在顶空瓶内侧，密封后置于固相微萃取加热台上平衡；
将老化后的萃取头插入顶空瓶中，顶空采样一定时间；
从顶空瓶中拔出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口，在250 ℃下解吸10 min，进行GC/MS检测。
色谱柱：HP-FFAP石英毛细管（50 m×0.32 mm×0.50 μm）；
载气：高纯氦气，流速1.5 mL/min；
进样口温度：250 ℃；
进样方式：不分流进样；
升温程序：初始温度50 ℃，保持1 min，先以10 ℃/min升至130 ℃，再以3 ℃/min升至200 ℃，最后以5 ℃/min升至230 ℃，保持20 min；
离子源：EI源；
电离电压：70 eV；
离子源温度：230 ℃；
传输线温度：250 ℃；
扫描方式：全扫描；
扫描范围：33～600 amu。
1.2.4 感官质量评价 感官质量评价按照行业标准YC/T 138—1998的方法打分，包括香气质（15 分）、香气量（20分）、余味（25分）、杂气（18分）、刺激性（12分）、燃烧性（5分）和灰色（5分），由中国农业科学院烟草研究所评吸专家组打分。
1.2.5 数据分析 用Excel 2021对数据简单处理；
应用SPSS统计软件进行方差分析和因子分析；
采用SIMCA 14.1统计分析软件进行OPLS-DA分析和聚类分析。
2 结 果
2.1 不同烤烟品种常规化学成分含量分析
由表1可知，常规化学成分在不同品种间存在广泛变异。6种常规化学成分中，钾的变异系数最小为10.67%，氯的变异系数最大为64.93%，说明在不同品种中氯含量变化大，主要是红花大金元和革新三号的氯含量显著高于其他5个品种，导致氯含量数据的离散程度变大。两糖比、钾氯比和氮碱比是判断优质烟叶的重要指标，一般认为中部烟叶两糖比≥0.8、钾氯比≥4、氮碱比0.7～1为优质烟叶[19]。在本研究中，7个样本烟叶的两糖比和钾氯比均在适宜范围，氮碱比除NC82和大白筋599外，其他5个品种略高于1，小黄金1025的氮碱比显著高于K326、NC82、G28和大白筋599。
2.2 不同烤烟品种致香物质含量分析
由表2可知，7个烤烟品种共检测出72种致香物质，包括类胡萝卜素降解产物24种，叶绿素降解产物1种，棕色化反应产物24种，苯丙氨酸类降解产物8种，类西柏烷类降解产物3种，其他致香物质12种。这些致香物质在7个品种中均检测到，含量存在明显差异。总致香物质含量红花大金元最高，NC82、革新三号、K326、大白筋599、G28和小黄金1025依次递减。类胡萝卜素降解产物红花大金元最高，显著高于其他6个烤烟品种，可能是红花大金元的类胡萝卜素合成能力强于其他品种。叶绿素降解产物K326、NC82、红花大金元、革新三号和大白筋599含量较高，显著高于G28和小黄金1025。棕色化反应产物红花大金元含量最高，显著高于G28、K326和小黄金1025，其他品种含量差异不显著。苯丙氨酸类降解产物和类西柏烷类降解产物在不同品种中差异显著，均为革新三号含量最高，大白筋599含量最低。其他类致香物质含量为红花大金元最高，小黄金1025、革新三号、K326、NC82、G28和大白筋599依次递减。
2.3 致香物质OPLS-DA分析和聚类分析
采用有监督的模式识别方法OPLS-DA进一步对致香物质進行研究，由图1（a）可知，每个品种的3个样本基本聚集在同一个区域，说明重复性较好。其中K326、G28、小黄金1025、NC82和革新三号5个品种分布区域的相对距离较近，说明致香物质差异较小，大白筋599和红花大金元分别分布在不同的区域。此外，评价OPLS-DA模型质量有3个关键指标，R2X、R2Y和Q2，其中R2X越接近1说明模型能代表的样品信息越多，R2Y和Q2越接近1说明模型的稳定性和预测性越好，该模型的R2X=0.864，R2Y=0.821，Q2=0.816，说明模型代表的样本信息较多，稳定性和预测性较好。聚类分析是一种多元统计分析，根据样品质量特征的相似性逐步聚集样品。由图1（b）可知，当纵坐标为6时，7个烤烟品种可聚为3类，K326、G28、小黄金1025、NC82和革新三号聚为一类，大白筋599和红花大金元分别聚为一类。以上结果表明，K326、G28、小黄金1025、NC82和革新三号的香气物质较为相似，大白筋599和红花大金元与其他品种相似度较低，OPLS-DA和聚类分析得到了相同的结论。
2.4 致香物质因子分析及差异代谢物分析
因子分析是一种通过降维方法将多个变量转换为少数综合变量的统计方法，从而简化数据并解释大部分原始信息。该方法已广泛应用于烟叶致香物质成分的研究[3， 20]。本研究对7个烤烟品种72种致香物质的含量进行因子分析，特征值、方差贡献率和累积方差贡献率见表3。前5个因子的累积方差贡献率为82.655%，且特征值均大于1，表明前5个因子可以解释7个烤烟品种致香物质的大部分变化信息。相应得到的因子载荷矩阵，根据变量在5个因子上的负荷，筛选出28种致香物质对香气成分贡献较大，包括：类胡萝卜素降解产物15种，编号为2、4、5、6、7、8、10、12、13、15、16、18、19、20和22；
棕色化反应产物7种，编号为27、29、31、35、36、47和48；
苯丙氨酸类降解产物3种，编号为51、55和56；
类西柏烷类降解产物2种，编号为58和60；
其他类致香物质1种，编号为63。
为了更加全面地了解7个烤烟品种致香物质差异，对28种比较重要的致香物质进行OPLS-DA分析。该模型中变量权重VIP可以表明样品之间的关键差异代谢物，VIP值越大，说明该成分对7组样本分类判别的影响强度和解释能力越强。以VIP>1为筛选标准[21]，筛选到17种香气物质（图2）：β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮-1、巨豆三烯酮-2、巨豆三烯酮-3、巨豆三烯酮-4、3-羟基-β-二氢大马酮、二氢猕猴桃内酯、反式-2，4-庚二烯醛、六氢假紫罗酮、5，6-环氧紫罗兰酮、糠醇、2-乙酰基吡咯、2-吡咯甲醛、吡喃酮、麦芽酚、茄酮和降茄二酮。
2.5 感官质量评价分析
感官质量评价结果（表4）显示，不同品种之间的感官质量得分差异较小。燃烧性和灰色各品种得分一致，香气质、香气量、余味、杂气和刺激性各品种得分差异不大，其中革新三号的综合得分相对较高，突出表现在香气质好，余味舒适，杂气少。
3 讨 论
在相同生态环境和栽培措施下，烟叶化学成分和香气物质的差异主要由遗传因素决定[4，22]。本研究结果表明，7个不同品种中部叶的两糖比和钾氯比均在适宜范围，钾氯比的变异系数较大，其中K326、NC82、G28、小黄金1025和大白筋599的钾氯比值较高，这可能与氯离子含量低有关。7个烤烟品种氮碱比整体偏高，均在1左右，只有NC82和大白筋599在适宜范围，分析原因可能是当地氮肥施用量过高。
致香物质分析结果发现，7个烤烟品种的致香物质种类完全相同，但含量却有较大差异。红花大金元中类胡萝卜素降解产物在7个品种中含量最高，可能与该品种鲜烟叶中类胡萝卜素含量高有关[23]。王国平等[24]通过SSR标记对60份烤烟种质进行分类，大白筋599、红花大金元和革新3号聚在一类，G28、K326、NC82和小黄金1025聚在一类。轩贝贝等[25]和丁永亮等[26]均证实了红花大金元与其他烤烟品种的遗传相似性很低，有明显的特异性。本研究通过烤后烟叶致香物质进行聚类分析，将7个烤烟品种分为3类，聚类结果与前人研究相似，仅革新三号有差异，可能与其烘烤工艺有关。17种差异代谢物中，β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯、反式-2，4-庚二烯醛和5，6-环氧紫罗兰酮等在烤烟中含量较高的香气物质均在红花大金元中含量最高，显著高于其他6个品种。巨豆三烯酮-1、巨豆三烯酮-2、巨豆三烯酮-3和巨豆三烯酮-4在NC82和红花大金元中含量均较高，这类致香物质具有烟草甘甜香气，可改善烟香，柔和丰满，掩盖杂味[27]。2-吡咯甲醛和降茄二酮在革新三号中含量高于多数其他品种，仅2-吡咯甲醛在小黄金1025中的含量与革新三号基本一致。吡喃酮在小黄金1025中的含量最高，且显著高于红花大金元和大白筋599。茄酮在NC82、G28和革新三号中含量较高，显著高于其他4个品种。该致香物质具有类似胡萝卜的香味和甘草、茶样芳香，虽然在烤后烟叶中的含量不是很高，但可提高卷烟香味品质[28]。糠醛和麦芽酚仅在大白筋599中含量很低，其他品种之间差异不显著，糠醛有甜味、似甜杏仁香，麦芽酚具有愉快的焦甜香味[29-30]。
感官质量评价发现，不同品种之间差异较小，可能是因为种植在同一生态条件下的原因，进一步证实了生态条件是影响烟叶品质的重要因素[31]。虽然红花大金元的致香物质含量最高，但感官质量评价得分并不高，表明烤后烟叶的感官质量是由多种因素共同影响，其机理有待进一步研究。
4 结 论
对7个优质烤烟核心亲本烤后烟叶质量比较结果表明，两糖比和钾氯比均在优质烟叶适宜范围，大部分品种的氮碱比偏高，可适当降低山东临沂烟区氮肥施用量，达到优质烟叶的生产标准；
根据各类致香物质含量，可将7个烤烟品种分为3类，G28、K326、小黄金1025、NC82和革新三号分为一类，大白筋599和红花大金元各为一类。因子分析筛选到28种对7个烤烟品种香气贡献较大的致香物质，进一步通过OPLS-DA分析筛选出17种差异物质，可根据香气育种目的挑选合适的亲本。
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