马启风，高红梅，王炳然，张 淼，陈 晶，唐秋竹，邱智东
（长春中医药大学药学院，长春 130117）
大青龙汤出自张仲景著《伤寒论》[1]，书中记载：“麻黄六两（去节），桂枝二两（去皮），甘草二两（炙），杏仁四十枚（去皮尖），生姜三两（切），大枣十二枚（擘），石膏如鸡子大（碎），上七味，以水九升，先煮麻黄，减二升，去上沫，内诸药，煮取三升，去滓。”是治疗太阳病兼有里证的古方，具有发汗解表、清郁热、消肿镇痛、抗病毒的功效，主治外感风寒、兼有里热。临床常用于治疗哮喘，尤其善于治疗小儿哮喘[2-3]、小儿急性支气管炎、流感、暑热、急性肾炎、原发性皮肤样变、嗜睡等病症[4-6]。《中药复方制剂生产工艺研究技术指导原则（试行）》[7]明确中药复方制剂生产工艺研究应遵循“尊重传统用药经验”等基本原则和要求，应最大限度发挥或优于原有方剂的疗效。文献记载大青龙汤的使用方法为水煎服，但煎煮时间尚不明确，无法保证与传统用药的一致性。为同时确保大青龙汤煎煮的遵古特性及中药资源的充分利用，本实验以古籍记载制备方法建立标准图谱，对比分析指纹图谱相似度，优选出与标准图谱相似度接近且提高饮片利用率的工艺参数。
中药复方化学成分复杂，其药理作用具有多靶点、多层次特点，用指标成分含量评价提取工艺不具有整体性，而指纹图谱技术能全面、定量地反映中药所包含的已知成分和未知成分的种类和数量[8-10]，其图谱相似度越接近，煎煮液与原有方剂的组成成分越相同，从而保证复方的有效性和遵古性。出膏率可以反映药材成分的煎煮程度。熵权法[11-12]是一种根据各指标的分散程度，利用信息熵计算各指标权重的方法，避免人为因素带来的偏差，评价结果客观性更强，可以用于需要确定权重的过程。基于此，本研究对比分析指纹图谱相似度和出膏率，最终确定大青龙汤煎煮工艺参数，为其制剂生产工艺的研究及相关产品的开发与应用提供研究思路。
1.1 仪器
LC-2030 型高效液相色谱仪，日本Shimadzu 公司；
AB135-S 型精密十万分之一分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；
FA1204B 万分之一分析天平，上海精密仪器科技有限公司；
KQ-250B 型超声清洗机，昆山市超声仪器有限公司；
电磁炉，长春恒隆厨房设备有限公司；
煎药壶，潮州壶百饮电器实业有限公司。
1.2 材料
麻黄（批号：20211217），炙甘草（批号：20211108），桂枝（批号：20211218-01），燀苦杏仁（批号：20210812），石膏（批号：20211123），大枣（批号：20211072）均购自吉林省北药中药制药集团有限公司，生姜购于长春中医药大学旁边综合市场，经长春中医药大学翁丽丽教授鉴定，饮片各项标准均符合《中国药典》2020 版[13]相关规定，炙甘草由本实验组自行炒制，方法参照2015 版《浙江省中药炮制规范》[14]：取甘草片，照清炒法炒至表面黄色，微具焦斑时，取出，摊凉。盐酸麻黄碱对照品（批号：171241-201809）、盐酸伪麻黄碱对照品（批号：171237-201510）均购于中国食品药品检定研究所，甲醇，分析纯，天津新通精细化工有限公司；
乙腈，色谱纯，北京化工厂；
磷酸，色谱纯，北京化工厂；
水为屈臣氏纯净水。
2.1 处方分析
大青龙汤各饮片剂量为麻黄六两、桂枝二两、炙甘草二两和燀苦杏仁四十枚，生姜三两，大枣十二枚，石膏如鸡子大，量器计量为“升”。《伤寒论》中的药物剂量“两”和“g”的换算，参考《中国古代科技史·度量衡卷》[15]，得出东汉1 两折合为 13.8 g，1 升约为现今200 mL，再结合非标准重量单位计量药物实物考证，石膏鸡子大折算剂量为60 g，杏仁一枚为0.3 g，大枣一枚为2.5 g，得处方一：麻黄82.8 g，桂枝27.6 g，甘草（炙）27.6 g，生姜（切）41.4 g，石膏（碎）60.0 g，杏仁（燀）12.00 g，大枣（擘）30.0 g。参考“十三五”规划教材《方剂学》以及现今临床常用剂量，一两折合为3 g，得处方二：麻黄12.0 g，桂枝6.0 g，甘草（炙）6.0 g，生姜（切）9.0 g，石膏（碎）18.0 g，杏仁（燀）6.0 g，大枣（擘）3.0 g。
2.1.1 供试品溶液的制备 按处方一、处方二称取各饮片，分别加水1 800 mL，先煮麻黄，减400 mL，去沫，入诸药，煮取至600 mL，200 目纱布滤过，-18℃冻存12 h 后冷冻干燥72 h，得各处方冻干粉。
分别精密称取各处方冻干粉0.1 g，置于100 mL具塞锥形瓶，精密加入80% 甲醇30 mL，超声20 min，放冷后用80%甲醇补足减失重量，滤过，取续滤液，过0.22 μm 微孔滤膜，即得。
2.1.2 对照品溶液的制备 精密称定盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品1.9 mg，置于2 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为0.95 mg·mL-1的混合对照品母液。
2.1.3 色谱条件 色谱柱为Platisil 5 μm ODS（4.6 mm× 250 mm），以0.15%磷酸（A）和乙腈（B）为流动相，梯度洗脱程序：0～10 min，4%～7% B；
10～20 min，7%～9% B；
20～22 min，9%～9% B；
22～32 min，9%～12% B；
32～40 min，12%～15% B；
40～65 min，15%～35% B；
65～80 min，35%～65% B，体积流量1 mL·min-1，柱温25℃，波长207 nm，进样体积5 μL。
2.1.4 方法学考察
2.1.4.1 线性关系考察 精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液5、10、20、40、80、120、160 μL 置入2 mL 量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，即得浓度分别为2.375、4.75、9.5、19、38、57、76 μg·mL-1系列标准溶液，分别精密吸取系列对照品溶液5 μL 注入液相色谱仪，进行测定。得回归方程分别为Y= 11 572X+1 518.8，r= 0.999 6，线性范围2.375～76 μg·mL-1，Y= 9 902.5X+232.9，r= 0.999 7，线性范围2.375～76 μg·mL-1。结果表明，在相应进样质量浓度范围内各成分线性关系良好。
2.1.4.2 精密度考察 取“2.1.1”法制备的处方一供试品溶液，精密吸取5 μL，重复进样6 次，记录峰面积，结果样品中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的峰面积RSD 分别为0.22%和0.20%，表明仪器精密度良好。
2.1.4.3 稳定性考察 取“2.1.1”法制备的处方一供试品溶液，分别于 0、2、4、8、12、24 h 按“2.1.3”项下方法进行测定，记录峰面积，结果样品中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的峰面积RSD 分别为1.09%和1.19%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。
2.1.4.4 重现性考察 平行制备6 份处方一供试品溶液，按照“2.1.3”项下方法测定，计算盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量均值分别为1.02%和0.70%，RSD 为1.12%和1.75%，表明重现性良好。
2.1.4.5 加样回收率 精密称取已知含量的同一份大青龙汤样品共6 份，每份约0.1 g，分别加入一定量的对照品溶液，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果显示，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的平均加样回收率为98.88%和98.66%，RSD 为1.13%和1.10%（n= 6），表明该方法回收率良好。
2.1.5 剂量考察结果 结合表1，得出不同剂量处方麻黄饮片中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱总含量相差不大，证明各处方对饮片利用率基本一样。大青龙汤此次作为防疫方，在针对新型冠状病毒疫情时，应使用大剂量切中病机，迅速起效，基于此，本实验选用一两折合13.8 g。
表1 不同处方剂量考察结果 %
2.2 标准图谱的建立
供试品溶液的制备 按“2.1.1”项下处方一方法制备供试品。色谱条件，同“2.1.3”色谱条件。标准图谱，见图1。
图1 标准图谱
2.3 麻黄先煎去沫考察
原文记载为“以水九升，先煮麻黄，减二升，去上沫，再内诸药”，课题组前期对文献[16]的考证，发现麻黄是否去沫可能与生物碱类成分关系不大，但于本实验的成分煎煮是否有影响，是否也不需要。基于此，本研究以麻黄“先煎去沫”理论为切入点，以麻黄先煎去沫图谱为参照图谱，采用中位数法，设置时间窗宽度为0.1，得到各图谱相似度，评价分析麻黄是否需要先煎去沫。图谱见图2。
图2 麻黄去沫指纹图谱
按处方一称取饮片，加水1 800 mL，入诸药，煮取至600 mL，200 目纱布滤过，-18℃冻存12 h后冷冻干燥72 h，即得麻黄未先煎去沫液冻干粉。按“2.1.1”法制备平行样品。
由图谱可得麻黄未先煎去沫图谱与标准图谱相似度分别达到0.947 和0.930，证明麻黄先煎去沫与否对大青龙汤的成分提取没有太大影响，且麻黄先煎去沫不适用于实际生产，故本实验麻黄不用先煎去沫。
3.1 单因素考察
3.1.1 煎煮时间 称取大青龙汤处方量饮片，在料液比1:6、煎煮1 次的条件下，分别对煎煮时间1 h、2 h、3 h 进行考察。结果见表2，图谱见图3。与标准物质比较，随着时间的延长，出膏率逐渐增加，相似度逐渐降低，煎煮2 h 和3 h，出膏率和相似度变化不大，因此煎煮时间选择1、1.5、2 h 进行正交工艺优化。
图3 单因素试验指纹图谱
表2 大青龙汤提取工艺的单因素试验结果
3.1.2 料液比 称取大青龙汤处方量饮片，在煎煮1 h、煎煮1次的条件下，分别对料液比1:6、1:12、1:18进行考察。结果见表2，图谱见图3。与标准物质相比，出膏率逐渐增加，相似度逐渐降低，料液比为1:12与1:18 时，相似度变化不大，考虑节约溶剂用量，因此料液比选择1:6，1:8，1:10 倍进行正交工艺优化。
3.1.3 煎煮次数 称取大青龙汤处方量饮片，在煎煮1 h、料液比1:6 的条件下，分别对煎煮次数1 次、2 次、3 次进行考察。结果见表2，图谱见图3。与标准图谱相比，发现随煎煮次数增加，出膏率逐渐增加，相似度逐渐降低，煎煮3 次时，相似度的结果已不是很高，故将最高煎煮次数确定为3 次，进行正交工艺优化。
3.2 正交试验设计
在前期单因素试验结果的基础上，优化煎煮时间（A）、料液比（B）、煎煮次数（C）三个影响因素，以相似度及出膏率的综合评分为评价指标，采用 L9（34）正交试验设计优选最佳煎煮工艺参数，实验结果见表3，方差分析及结果见表4，图谱见图4。
图4 正交试验指纹图谱
表3 大青龙汤提取工艺的正交试验设计与结果
表4 大青龙汤提取工艺的正交试验方差分析结果
3.3 熵权计算权重
熵权法[17-18]是对指标体系客观赋权的方法，其指标的变异程度越小，信息熵就越大，其对应的权值也应该越低，则该指标对综合评价的影响就越小，反之，该指标影响就越大。经计算得出相似度和出膏率的权重为0.492，0.508。
本研究对正交试验进行极差和方差分析，结果显示各考察因素对考察指标影响大小的次序为C ＞A ＞B，根据评分值确定A3B1C2为最佳煎煮工艺，即煎煮2 h、加6 倍量水、煎煮2 次。本研究进一步对正交试验综合评分结果进行方差分析，发现正交实验因素C（煎煮次数）有显著性差异，因素B（料液比）和因素A（煎煮时间）没有显著性差异，即煎煮次数对结果影响最大，料液比和煎煮次数对实验结果影响不大，考虑实际生产所用时间和资源成本，故减少时间的消耗，确定最佳工艺为用A2B1C2即煎煮1.5 h、料液比1:6、煎煮2 次。
3.4 工艺验证实验
称取大青龙汤全方药材共281.4 g 3 份，按照上述所得最优大青龙汤煎煮工艺进行验证试验，结果见表5，可见3 批样品综合评分的RSD 值均在2%以内，说明此煎煮工艺合理、稳定、可行。
表5 大青龙汤的工艺验证试验
新冠疫情暴发以来，造成了极大的恐慌，也给人们生命安全造成了很大的威胁，而在这次疫情防控中，中医药广泛参与新冠肺炎的治疗，深入介入诊疗全过程，有效发挥了积极作用，助力中国疫情局势实现逆转，作为防疫方的大青龙汤为汉代记载方剂，疗效确切，应用历史久远，但可能存在历代方义衍变，古今提取容器、提取方式的变化等问题，故为实现传统制法与现代提取工艺的质量一致性和有效性，应参考古籍，与现代技术相结合来对大青龙汤的提取工艺进行研究。
指纹图谱是一种综合、可量化的鉴定手段，可以对中药复方制剂中多组分、多靶点进行整体评价[19-20]，指纹图谱大多用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性，近年来应用于中药复方的提取工艺。研究[21-23]在评价提取工艺时，不仅考察指标成分含量和出膏率，还包括指纹图谱相似度，故本研究在遵古的基础上，与现代技术相结合，考察了处方饮片的现代临床剂量以及麻黄饮片在煎煮过程中的加入方式，确定处方关键信息，得到标准图谱，建立出膏率和图谱相似度为主的工艺评价体系，与指标成分含量最大的评价体系相比，本方法不仅兼顾了中药复方多成分作用特点，还能有效克服在煎煮工艺考察中采用单一评价指标的局限性，最大程度保证尊重传统用药的原则，为后续大青龙汤的工业生产提供科学依据。
参考古籍原文记载，本实验以水为提取溶剂，采用煎煮法进行提取。影响提取工艺的因素为料液比、煎煮次数与煎煮时间，且因素间有交互作用。本实验在单因素试验确定各因素水平的基础上，进一步运用高效率、快速、经济的正交设计优化大青龙汤现代煎煮工艺参数，所得参数稳定可行。最终确定煎煮工艺参数为煎煮2 次，加6 倍水，煎煮1.5 h。此工艺图谱与标准图谱相似度为0.901，出膏率18.3%，可以看出本实验采取的工艺优化未对大青龙汤应有成分造成破坏，标准图谱与工艺优化后大青龙汤图谱基本一致，且煎煮效率有所提升，为其他复方的现代工业化生产提供了参考。
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