曹 强, 刘小龙
(新疆维吾尔自治区人民医院烧伤创面修复外科, 乌鲁木齐 830001)
糖尿病足(Diabetic foot,DF)是糖尿病较为常见的并发症之一,其病情复杂,往往造成患者残疾甚至死亡[1],给患者身心带来伤害,也给其家庭和社会带来沉重经济负担[2]。超过1/4的糖尿病患者自患病起就终生面临DF的风险,因此早期正规治疗溃疡创面,促进愈合成为有效降低DF患者致残甚至死亡的重要手段[3]。重组人生长激素(Recombinant human growth hormone,rhGH)近年来临床研究较多,就创面修复而言,它可以通过促进创面炎症细胞聚积,表皮细胞、成纤维细胞及巨噬细胞分裂增殖,从而加速创面修复,尤其在烧伤领域应用较广[4-6],并取得较好效果。鉴于其用于治疗烧伤创面过程中具有一定的升高血糖的副作用[7],将其应用于DF患者的研究报道较少。本团队前期研究表明,将小剂量(0.2～0.6 IU/kg) rhGH以创周点状注射的方式应用于2型糖尿病(T2DM)模型大鼠背部创面,不仅可有效促进创面愈合,缩短创面愈合时间,且对血糖无明显影响[8]。因此,本文拟进一步探索rhGH促进T2DM模型大鼠创面愈合的机制,现报道如下。
1.1 实验材料健康成年SPF级Wistar大鼠35只,体重180～220 g,雄性,纯系,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司[许可证号:SCXK(京)2019-0010)]。白蛋白(ALB)测定试剂盒(南京建成科技有限公司),鼠酸性成纤维生长因子(aFGF)试剂盒、鼠血管内皮生长因子(VEGF)试剂盒、鼠表皮细胞生长因子(EGF)试剂盒、鼠胰岛素样生长因子-1(IGF-1)试剂盒(均购自江苏鱼跃医疗设备股份有限公司),小动物麻醉机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司),动物饲料(江苏协同医药生物工程责任有限公司),链脲佐菌素配制液(阿拉丁试剂上海晶纯试剂有限公司),注射用重组人生长激素(赛增)(长春金赛药业有限责任公司,生产批号:201905029)。
1.2 实验方法
1.2.1 T2DM大鼠建模 35只大鼠适应性喂养1周后,选取28只连续4周喂养高糖高脂饲料(配比:普通鼠饲料∶猪油∶蔗糖∶胆固醇=79∶10∶10∶1),第6周开始隔天腹腔注射链脲佐菌素溶液(50 mg/kg),共3次,检测空腹血糖(禁食12 h不禁水),鼠尾末梢血空腹血糖>11.1 mmol/L为T2DM大鼠建模成功。28只大鼠均建模成功。
1.2.2 创面建模 28只T2DM大鼠及7只正常大鼠脱毛、麻醉后切取背部2 cm×2 cm全层皮肤,共同建立创面模型。
1.2.3 实验分组和用药 对照组:7只正常大鼠的背部创面在每日换药过程中,创周点状注射1 mL 0.9%生理盐水2周。28只T2DM创面模型大鼠分为4组,每组7只。(1)模型+盐水组:每日创面换药过程中创周点状注射1 mL 0.9%生理盐水2周;(2)GH2组:每日创面换药过程中创周点状注射生理盐水稀释后的rhGH(rhGH剂量为0.2 IU/kg)1 mL,持续2周;(3)GH4组:每日创面换药过程中创周点状注射生理盐水稀释后的rhGH(rhGH剂量为0.4 IU/kg) 1 mL,持续2周;(4)GH6组:每日创面换药过程中创周点状注射生理盐水稀释后的rhGH(rhGH剂量为0.6 IU/kg)1 mL,持续2周。此后每日常规创面换药至创面愈合。
1.3 检测指标和标本收集各组分别于干预第0、14 d时取鼠尾末梢血,用于检测aFGF、VEGF、EGF、IGF-1、ALB的水平。
2.1 各组干预前后血清aFGF水平比较除模型+盐水组外,其余各组内干预后14 d aFGF水平均较干预前升高(P<0.05);干预后14 d,与对照组相比,模型+盐水组aFGF水平降低(P<0.05);GH6组aFGF水平明显升高,与模型+盐水、GH2、GH4组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),见表1。
表1 各组干预前后血清aFGF水平比较
2.2 各组干预前后血清VEGF水平比较各组内干预后14 d VEGF水平均较干预前升高(P<0.05);干预后14 d,与对照组相比,模型+盐水组VEGF水平降低(P<0.05);GH6组VEGF水平明显升高,但与模型+盐水、GH2、GH4组比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表2。
表2 各组干预前后血清VEGF水平比较
2.3 各组干预前后血清EGF水平比较各组内干预后14 d,EGF水平均较干预前升高(P<0.05);干预后14 d,与对照组相比,模型+盐水组EGF水平降低(P<0.05);GH4组EGF水平明显升高,但与模型+盐水、GH2、GH6组比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表3。
表3 各组干预前后血清EGF水平比较
2.4 各组干预前后血清IGF-1水平比较各组内干预后14 d,IGF-1水平均较干预前升高(P<0.05);干预后14 d,与对照组相比,模型+盐水组IGF-1水平降低(P<0.05);GH6组IGF-1水平明显升高,与模型+盐水组比较,差异有统计学意义(P<0.05),见表4。
表4 各组干预前后血清IGF-1水平比较
2.5 各组干预前后血清ALB水平比较各组内干预后14 d, ALB水平均较干预前升高(P<0.05);干预后14 d,与对照组相比,模型+盐水组ALB水平降低(P<0.05);GH6组ALB水平明显升高,与模型+盐水、GH2、GH4组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),见表5。
表5 各组干预前后血清ALB水平比较
创面愈合过程主要由炎症反应期、修复增殖期和创面重塑期三个相互重叠组成[9]。该过程由许多生长因子参与调控,如FGF、VEGF、EGF、IGF-1等等[10]。本研究通过检测这些生长因子干预前后的表达水平来间接探索rhGH促进创面修复的机制。其中,FGF最早是从牛垂体中提取获得[11],有两个亚型,即酸性成纤维生长因子(aFGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF),其中aFGF是细胞增殖和分化的有效促进因子[12]。炎症期,它可以趋化炎症细胞并加速其增殖、分化;增殖期,它可以直接促进细胞的增殖、分化,加速肉芽组织形成,同时还可以促进胶原蛋白的合成、分泌和沉积,另外,它还能直接促进毛细血管再生[13]。VEGF一度被认为是特异性很高的血管内皮细胞有丝分裂原,现已成为研究最为广泛的血管生成刺激物[13]。炎症期,它可以增加血管通透性,加速清除坏死组织;增殖期,可促进创面肉芽组织形成[14]。EGF最早是在研究神经生长因子时被发现,炎症期其生理作用与aFGF和VEGF类似;增殖期,它可以加速创面毛细血管再生,并促进胶原蛋白、糖胺聚糖的合成,同时促进创面胶原蛋白的沉积和纤维结缔组织增生;创面修复中晚期,它可以促进创面上皮化,加速创面收缩,还可以调节创面拉伸强度[15-16]。IGF-1最早是在研究生长激素过程中被发现[17]。炎症期,其处于低水平状态;增殖期,它可加速创面肉芽化;重塑期,其表达达到高峰[18]直接加速创面上皮化并增加其强度。另外,ALB作为评价营养状态的重要指标,在创面愈合中也起着至关重要的作用,它不仅能够维持正常生理功能,也能为创面修复提供底物,故而也被列入检测指标。
本研究结果显示,各组大鼠干预14 d后,血清中aFGF(除模型+盐水组)、VEGF、EGF、IGF-1、ALB水平均较干预前明显升高,说明创面形成后,大鼠机体通过提高上述因子分泌水平启动创面修复过程。
rhGH干预14 d后,GH6组大鼠血清aFGF和ALB水平明显高于模型+盐水、GH2和GH4组,说明此浓度的rhGH疗效最好,与本团队前期研究[8]结果一致。本研究还发现,rhGH干预14 d后,T2DM大鼠各组间血清VEGF和EGF表达水平无明显差异,分析原因如下:(1)在一项探讨白藜芦醇促进受损骨骼肌恢复的作用机制研究中,发现内源性生长因子在外源性干预下表达峰值出现在干预后7 d,而本研究干预后采样点选择了第14天,而此时诸生长因子表达有所下降并逐渐趋于平稳[19];(2)本研究由于经费有限,样本量较小的问题较为突出,在更大样本的研究中结果可能会有统计学意义;(3)本研究样本测量的方法为采取鼠尾血,即测量的是全身生长因子水平,不除外VEGF、EGF创面局部表达浓度高的可能,目前尚未发现关于此类生长因子局部和全身表达差异的研究尤其是T2DM患者此方面的研究,此设想需在未来研究中进一步推理论证;(4)rhGH通过提高相应的生长因子表达水平从而促进创面愈合,诸多因子还包括本研究尚未涉及的血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)等,VEGF、EGF等因子表达虽有增高但未达质变水平,可能并非是rhGH的主要“驱动目标”;(5)为避免大剂量用药导致T2DM模型大鼠血糖水平升高,本研究采用小剂量用药,可能尚不足以明显刺激VEGF、EGF大量表达。
综上,本研究显示0.6 IU/kg rhGH明显提高了T2DM大鼠创面形成后aFGF、IGF-1的表达水平,促进了ALB的合成,至于PDGF、TGF等其他生长因子是否也会在此浓度rhGH的刺激下大幅提高表达水平进而促进创面愈合,尚需进一步研究。
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