曹 莹,张 爽,齐鹰博,张 娟,刘 闯,严雪瑞
(沈阳农业大学设施园艺教育部重点实验室,沈阳,110866)
蓝莓(Blueberry)是杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vacinium)植物。蓝莓为一种新兴小浆果,其富含多种对人体有益的营养成分,具有极高的经济价值,已经引起广泛关注,产业发展势头迅猛。截至2020年底,全国蓝莓栽培面积已达到6.64万hm2,总产量34.72万t[1]。类拟盘多毛孢真菌是为害蓝莓引起枝枯及叶斑病的主要致病菌类群,其包含3个属,分别为Pestalotiopsis、Neopestalotiopsis和Pseudopestalotiopsis,这3个属形态特征相似,直到2014年Neopestalotiopsis和Pseudopestalotiopsis才从Pestalotiopsis中正式区分出来,成立新属。属间的差异可利用核糖体大亚基(Ribosomal Large Subunit,LSU)基因构建系统发育树来区分,种间的差异可利用核糖体内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS)、β-微管蛋白(Bete-tubulin,TUB)和转录延伸因子-1(Transcription elongation factor-1,tef1)基因联合构建系统发育树来区分[2]。截至目前,国内外已报道为害蓝莓的类拟盘多毛孢真菌有8个种,分别属于Pestalotiopsis属和Neopestalotiopsis属,目前没有发现Pseudopestalotiopsis属真菌为害蓝莓的情况。其中,Pestalotiopsisguepini可引致阿根廷蓝莓茎枯病,主要为害“密斯提”“夏普蓝”“蓝丰”品种[3];P.clavispora(现已更名为Neopestalotiopsisclavispora)和P.neglecta在智利为害北高丛和南高丛蓝莓,造成溃疡病和枝枯病[4];P.photiniae引起吉林产地矮丛蓝莓叶斑病[5];P.trachicarpicola为害广西兔眼蓝莓引起叶斑病,同年还发现福建兔眼蓝莓枝枯病是由N.chrysea为害引起的[6-7];贵州蓝莓枝枯病由P.vismiae[8]为害引起;N.rosae引起了秘鲁蓝莓枯萎病[9]。
本实验室前期在福建、四川和云南等地区采集了蓝莓枝枯病样,发病枝条上的病斑褐色,边缘有深褐色晕圈,严重时整枝枯死,后期病斑上着生黑色小颗粒。对这些病样进行组织分离,其后进行单孢分离和纯化,获得供试菌株,并通过形态观察和ITS序列比对初步确定其属水平的分类地位。其后,将其与所在属内的已报道为害蓝莓的种群进行比对。在进行拟盘多毛孢属供试菌株与已报道菌株比对时,发现了5株菌疑似为为害蓝莓的新纪录种或新种。为明确这5株菌的分类地位,采用核糖体大亚基(LSU)、内转录间隔区(ITS)、β-微管蛋白(TUB)和转录延伸因子-1(tef1)4段基因分别进行了属水平、骨架树水平和近缘种水平等三层次的系统发育分析,并结合传统形态学对其进行了鉴定。
1.1 供试菌株
供试菌株编号分别为FZXM0222A、SCCD01Ch、SCCD01Ck、YN06E2和YN06F,分别来自福建、四川和云南,于-80 ℃条件下备用保存。
1.2 致病性测定方法
采用活体枝条回接法测定分离菌株的致病性。在长势均匀的盆栽2年生健康蓝莓中,选取粗细及软硬程度一致的枝条进行摘叶处理,用酒精棉轻轻擦拭枝条进行消毒;之后用无菌解剖刀划伤枝条造成伤口。接种培养3 d的供试菌株的菌饼(直径5 mm),把菌饼带菌面贴在枝条伤口处,用无菌脱脂棉与无菌水进行保湿处理,重复3次。以5 mm PDA圆饼作为对照,其他步骤同上。将处理后的枝条放置在28 ℃下,48 h后摘除菌饼和对照PDA圆饼,10 d后测定病斑扩展长度,并从病斑处分离病原菌。
1.3 形态学鉴定方法
观察供试菌株的菌落形态、生长速度和产孢情况等。待供试菌株产孢后,用Olympus BX43显微镜观察其分生孢子的形态,测量分生孢子大小及顶端附属丝长度、基部附属丝长度等,拍摄分生孢子照片。每个供试菌株观察30个分生孢子。
1.4 DNA提取、PCR扩增及测序方法
DNA提取:供试菌株放置在马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)中,在回旋振荡器(125 转/min)上震荡培养6 d左右,用纱布滤掉多余的培养基后,清洗,烘干,收集菌丝;利用DNA提取试剂盒提取供试菌株DNA。
PCR扩增及产物测序:LSU、ITS、TUB和tef1各段基因的扩增引物、反应体系及扩增程序均参考石凌波[10]。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测以后,送至上海生工生物公司进行纯化和双向测序。
1.5 分子系统发育分析方法
采用三层次系统发育分析方法。
属水平系统发育树的建立:将供试菌株的LSU基因与类拟盘多毛孢真菌不同属代表菌株的LSU基因进行建树,从而将供试菌株鉴定到属级别。
骨架树水平系统发育树的建立:采用ITS、TUB和tef1 等3段基因联合建树,将供试菌株与上一步确定的属中种群代表菌株进行建树(为简化操作,近缘分支只选一个种群作为代表),从而确定供试菌株的近缘种分支。代表菌株的挑选参照Maharachchikumbura等[2]和Wang等[11]的系统发育树,具体代表菌株信息见表1。
表1 已知代表菌株信息及基因登录号
近缘种水平系统发育树的建立:采用ITS、TUB和tef1 等3段基因联合建树,将供试菌株与近缘种分支中的所有菌株进行建树分析,从而确定供试菌株的分类地位。
使用MAFFT v.7对基因序列进行比对。使用MEGA X 软件[12]构建不同层次的系统发育树,采用最大似然法ML,Bootstrap值为1 000。
2.1 供试菌株的致病性及形态学特征
供试菌株在PDA上25 ℃培养15 d后,菌落直径达到90 mm,菌落正面为白色,背面乳白色至淡黄色;菌落呈放射状生长,生长较为旺盛,轮纹不明显(见图1A和B)。后期产孢,且有黑色稀疏的子实体(见图1D)。其分生孢子大小为(20.7 ～28.8)μm×(4.7～7.2)μm;具2～3根顶端附属丝,长度为10.3～20.5 μm;基部附属丝长度为 3.5～7.0 μm;中间三色细胞同浅棕色,长度为13.2～18.0 μm(见图1 C)。该形态特征与P.kenyana相似。将供试菌株接种到健康的蓝莓枝条上,接种部位出现病斑并迅速扩展,对照组不发病。部分枝条接种后期病斑上产生黑色分生孢子盘,与采集到的蓝莓病样症状一致(见图1E、F和G)。
注:A-B:在PDA上25 ℃培养15 d的菌落正面和背面,C:分生孢子,D:菌落上产生的子实体,E:枝枯症状,F:致病性测定中接种菌株10 d后发病的枝条,G:致病性测定中10 d后的对照枝条。
2.2 分子系统发育树
属水平系统发育树:采用5株供试株与筛选所得的21株已知属代表菌株(表1)的LSU序列,以Monochaetiakansensis为外群,构建属水平的系统发育树。结果显示,5株供试菌株都属于Pestalotiopsis属,且自展值为99(见图2)。
图2 供试菌株与属级别代表菌株基于LSU序列采用ML法构建的属水平系统发育树
骨架树水平系统发育树:按照Maharachchikumbura等[2]的骨架树分支以及分支相近取其一的原则挑选出30个种的代表菌株(见表1)。采用ITS、TUB 和 tef1等3段基因进行联合建树,对5株供试菌与30株代表菌进行分析,以Neopestalotiopsisclavispora为外群。结果表明,5株供试菌单独形成一支,并与P.oryzae分支互为姐妹群,自展值为94(见图3)。
图3 供试菌株与种级别骨架树挑选代表菌株基于ITS、β-tubulin和tef1序列采用ML法构建的Pestalotiopsis属系统发育树
近缘种水平系统发育树:根据Maharachchikumbura等[2]和Wang等[11]构建的Pestalotiopsis属系统发育树,P.oryzae分支上的近缘种有P.rhodomurtus、P.kenyana、P.trachicarpicola、P.australasiae、P.macadamiae、P.doitungensis、P.menhaiensis和P.telopeae。采用ITS、TUB 和tef1等3段基因进行联合建树,将5株供试菌株与18株近缘种代表菌株进行对比分析,以Neopestalotiopsis.saprophyta为外群。结果显示,5株供试菌株与P.kenyana同属一支,自展值为83,因此确认5株供试菌株为P.kenyana(见图4)。
图4 供试菌株与所有近缘种代表菌株基于ITS、TUB、tef1序列采用ML法构建的近缘种系统发育树
本研究通过传统形态学和三层次系统发育分析对侵染蓝莓的新纪录种进行了鉴定,结果表明该种为P.kenyana,这是其为害蓝莓的首次报道。P.kenyana在我国还可引起茶树灰斑病[13]。截至目前,为害我国蓝莓的类拟盘多毛孢病原菌上升为6个种群,分别为P.photiniae、P.trachicarpicola、P.vismiae、P.kenyana、N.chrysea和N.clavispora。其中,N.clavispora在国内外均被报道可为害蓝莓。P.guepini、P.neglecta和N.rosae等3个种群目前在国内未发现。
该新纪录种(P.kenyana)与Pestalotiopsis属为害我国蓝莓的其他3个种在系统发育分析中容易区分;但在形态学上容易混淆,它们的分生孢子相近,只是附属丝特征上略有不同。P.kenyana的基部附属丝长度为3.5 ～7.0 μm,而P.photiniae和P.vismiae的基部附属丝稍短,分别为1.2～5.2 mm和2.8～5.2 mm。P.kenyana与P.trachicarpicola在顶端附属丝数量上略有差异,前者一般具有2～3根,后者通常有3根[13,14]。
本研究对来自福建、四川和云南等省份引起蓝莓枝枯病的5株类拟盘多毛孢病原菌进行了种的鉴定,今后还需进一步测定其对不同蓝莓品种的致病性及对常规防控药剂的抗药性,进而为田间防控提供参考。
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