姜惠心，祁子泰，高修歌,2，郭大伟,2，季辉,2，彭麟,2，江善祥,2*
(1. 南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095 2. 南京农业大学兽药研究评价中心，江苏 南京 210095)
犬乳腺肿瘤(canine mammary tumor，CMT)为宠物临床中最常见的肿瘤疾病之一，约占雌性犬肿瘤疾病的25%～42%[1]。受年龄、遗传、环境污染及饲养习惯等因素的影响，犬乳腺肿瘤呈现出年轻态、复杂化、恶性率高等特征。目前犬乳腺肿瘤的临床治疗以手术为主，结合化学治疗可有效降低其复发和转移率。罹患乳腺肿瘤的多为老龄犬只，手术风险高且不易完全切除，而化学治疗在犬乳腺肿瘤早期及术后化疗均展示出良好的前景。国外已批准马赛替尼、磷酸托格拉尼等化学小分子药物作为宠物临床的肿瘤药物，而我国尚未有宠物专用抗癌药物的批准上市，在宠物临床面临无合法合规抗乳腺肿瘤药物使用的境地。为加快推进宠物临床急需用药的研发进程，利用我国现有医药资源进行技术开发，更好满足宠物临床治疗药物的需求，我国农业农村部第330号公告发布了《人用化学药品转宠物用化学药品注册资料要求》，进一步推进现有药物转为宠物用药的研发进程。加快创制犬用抗乳腺肿瘤药物，将为满足宠物临床抗癌用药需求，提高患犬生活质量和福利，并为促进宠物经济快速发展提供支撑。
如今，我国宠物诊疗已进入高质量发展时期，创新性药物是宠物产业健康发展的急需品和必需品，如何开发出具有自主知识产权的宠物肿瘤药物，还应重视宠物肿瘤发病机制的研究，开发宠物专用药物的筛选工具，建立宠物肿瘤疾病研究模型，制订宠物肿瘤药物临床评价指南，以及完善宠物肿瘤药物新药注册与评审机制。宠物肿瘤药物的开发与应用具有广阔前景，为提高宠物生存质量和促进宠物经济发展提供物质基础，也将为患犬及宠主带来新的希望。本文对国内外报道的潜在有效抗犬乳腺癌小分子药物的研究进展进行综述，以期为国内抗犬乳腺肿瘤药物的研发提供理论参考。
1.1 流行病学
犬为乳腺肿瘤发病率最高的哺乳动物，未绝育雌性犬CMT发病率为71%，恶性肿瘤占比更是高达50%[1]，年龄、品种、绝育、饮食以及饲养环境等多种因素均会对其发病造成影响。CMT多发于中老年雌犬，其发病及恶变风险随年龄增长呈持续升高趋势。该病高发于小型犬，贵宾犬、博美犬、蝴蝶犬以及我国本土的西施犬、京巴等品种发病风险均较为突出[2]。绝育情况对CMT发病率具有巨大影响，首次发情前进行绝育可将发病风险降低至0.5%[3]。
我国宠物犬CMT发病风险较大，主要与我国犬只年龄分布、品种偏好及绝育普及度相关。据2019宠物白皮书统计，我国5岁以上宠物犬占比达40%，老龄犬数量呈增长趋势，限于早年宠物保健意识普及度较低，老龄犬多未进行早期绝育。同时，受法律、风俗、居住环境等因素影响，50%的宠物主选择饲养小型犬，贵宾犬更是作为最受欢迎的犬种总饲养量占比22.6%。据常宏建等[4]临床调研，我国部分地区CMT发病率可达40.8%，恶性肿瘤占比接近50%，远高于绝育普及率高的发达国家。
目前兽医临床将外科手术作为CMT的主要治疗方式。由于单纯的手术疗法难以根除病灶，肿瘤常发生转移、扩散，造成CMT术后生存期较短，复发率高达58%[5]。同时，CMT发病以老年犬为主，大量病例限于脏器机能难以进行手术。推广化学疗法可实现对外科疗法应用局限性的有效补充，提高临床治疗的有效性与应用性。
1.2 化学治疗
化学疗法(chemotherapy)简称化疗，即对机体组织内病原体所致疾病及肿瘤的化学药物治疗。肿瘤细胞增殖能力较强，利用化学药物可以通过多种途径干扰肿瘤细胞DNA的复制、转录、翻译过程，从而诱导有丝分裂活跃的细胞凋亡，达到杀伤肿瘤的目的。临床上可根据治疗目的进行根治性化疗(radical chemotherapy, RC)、姑息性化疗(palliative chemotherapy, PC)、辅助化疗(adjuvant chemotherapy，AC)、节拍化疗(metronomic chemotherapy，MC)等多种治疗方案，以缓解症状、改善预后、预防复发以及增强其他疗法的治疗效果。
临床治疗中通常对具有复发和转移风险或体况难以支持手术的CMT患犬采取化学疗法，常用的化疗药物主要包括烷化剂、铂类化合物、抗微管蛋白类、抗肿瘤抗生素、抗代谢类药物、靶向治疗药物及其他药物。目前研究显示，宠物肿瘤最常用的烷化剂和铂类药物对CMT疗效欠佳[6]，临床前试验和临床试验研究已经发掘了诸多具有杀伤犬乳腺肿瘤细胞药理学作用的化合物，为CMT专用药物的开发提供了方向。
2.1 常规药物
2.1.1 长春瑞滨
2.1.1.1 药理性质
长春瑞滨(vinorelbine)为抗微管蛋白类药物，具有细胞周期特异性。该类药物可进入肿瘤细胞内与微管蛋白结合，抑制其聚合为微管，并促使微管解聚，导致肿瘤细胞周期停滞于M期，诱导肿瘤细胞凋亡。相关研究表明，长春瑞滨可通过抑制肿瘤细胞迁移、侵袭以及上皮间质转换过程(epithelial-mesenchymal transition，EMT)以降低其移动性，抑制癌细胞的转移。在人类医学的初步临床研究中，长春瑞滨比长春新碱具有更广泛的抗肿瘤作用，这可能由于细胞内药物蓄积量更大和细胞内药物浓度峰值较高所致[7]。该药缺乏对肿瘤组织的选择性而具有较严重的剂量相关毒性，临床常见骨髓抑制和胃肠道反应，以中性粒细胞减少症、呕吐等为主要表现。
2.1.1.2 临床应用
长春瑞滨是目前治疗转移性及复发性乳腺癌最有效的药物之一，临床研究数据证实长春瑞滨单药治疗乳腺癌的疗效为30%～45%，其联合用药方案用于对蒽环类药物耐药的人晚期乳腺癌的治疗有效率可达40%～70%[8]。在临床治疗中CMT转移率与复发率较高，因而该药在CMT治疗中具有巨大潜力。目前，长春瑞滨已进行犬的Ⅰ期与Ⅱ期临床试验，建议以15 mg/m2的长春瑞滨作为治疗犬乳腺肿瘤的起始剂量，中性粒细胞减少症被确定为剂量限制的毒性作用[9]。一项长达12年的临床研究显示，长春瑞滨可作为安全且可耐受的化疗药物应用，且对犬肺癌、组织细胞肉瘤、淋巴瘤、乳腺肿瘤和尿囊过渡细胞癌等具有抗肿瘤活性，其兽医临床价值尚未完全发挥，在CMT治疗中具有广阔应用前景[10]。
2.1.2 紫杉醇
2.1.2.1 药理性质
紫杉醇(paclitaxel)为二萜类生物碱，属于抗微管蛋白类药物。该药可诱导和促进微管蛋白聚合，抑制其解聚，稳定微管，使肿瘤细胞有丝分裂周期长期阻滞于G2/M期而诱导其裂解。该药最早于1967年由美国科学家Wani和Wall从短叶紫杉(taxus brevifolia)中提取，并于1994年被FDA批准用于治疗人转移性乳腺癌。一项体外研究表明，紫杉醇可通过抑制PI3K/AKT信号通路和激活MAPK信号通路，增加犬乳腺癌细胞内固有凋亡，从而抑制肿瘤细胞增殖[11]。
2.1.2.2 临床应用
由于紫杉醇助溶剂乙醇和聚乙氧基化蓖麻油(cremophor-EL)会导致犬严重的急性过敏反应，该药临床应用受到限制。然而，经过剂型改良，美国食品与药品管理局(FDA)兽药中心于2014年批准了注射用紫杉醇纳米制剂(paccal vet®CA-1)用于可切除和不可切除的鳞状细胞癌和不可切除的Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ期犬乳腺癌，已在兽医临床治疗CMT中广泛应用[12]。根据紫杉醇在其他物种中的安全性及其不含聚乙二醇化合物的改良配方，紫杉醇纳米药物CA-1已投入研发并进行了Ⅰ/Ⅱ期临床试验研究，其在犬体内的最高耐受量可达150 mg/m2，快速分布于全身组织，消除半衰期为3 h。欧洲在此试验基础上开展了单组临床试验和开放性试验，为期14周，针对不可切除的二级或三级犬乳腺肿瘤的临床研究表明，试验结束后，紫杉醇纳米药物最终有效率(7%，P值0.048)和可观察到的生物学有效率(23%，P值0.012)均高于洛莫司汀[13]，且毒副作用为一过性的或临床可控的反应，证实紫杉醇纳米胶束制剂可安全有效治疗犬乳腺肿瘤。
2.1.3 多柔比星
2.1.3.1 药理性质
多柔比星(doxorubicin, DOX)，又称阿霉素(adriamycin, ADM)，属于蒽环类抗生素。DOX可插入细胞DNA双链、抑制DNA解超螺旋拓扑异构酶II，通过产生超氧基自由基和破坏细胞膜结构等机制起到杀灭肿瘤细胞的作用。DOX是人类医学临床中最为有效和常用的化疗药物之一，被视为治疗乳腺癌的一线药物。袁榕[14]证明DOX可通过激活caspase家族，改变凋亡因子表达等途径诱导犬乳腺细胞凋亡，揭示了DOX在犬乳腺肿瘤治疗中的应用前景。该药副作用相对较多，存在中度的胃肠道和骨髓抑制，并对犬具有心脏毒性，尤其对罗威纳、大丹、杜宾和拳师有品种倾向性，临床应用中还需注意给予抗过敏药物以降低急性过敏反应风险[15]。
2.1.3.2 临床应用
DOX是目前兽医临床应用较多的化疗药物之一，可单独使用或联合其他药物用于淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、肉瘤等多种犬猫肿瘤的临床治疗。由Kuntz等[16]1998年对14只犬的临床研究，DOX与顺铂联用治疗CMT可显著改善患犬预后情况，未接受治疗的患病犬死亡率为接受化疗的3.62倍。Nagamatsu等[17]利用siRNA下调犬Bcl-2基因的表达，促进犬乳腺癌细胞凋亡而增加其对的DOX敏感性，为提高该药临床应用提供了新的思路。DOX疗效卓越，治疗方案选择多样，在人乳腺肿瘤治疗中应用广泛，在CMT治疗中也同样具有较大的推广价值。
2.1.4 5-氟尿嘧啶
2.1.4.1 药理性质
5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)于1957年被首次合成，为5号位氢被氟取代的尿嘧啶类衍生物，在临床中作为实体肿瘤首选药物而广为应用。该药为胸苷酸合成酶抑制剂，在体内代谢后可同胸苷酸合成酶结合，使肿瘤细胞因胸苷酸缺陷致死，也可通过与DNA、RNA结合干扰合成代谢抑制肿瘤细胞活性。5-氟尿嘧啶有骨髓、胃肠道和神经毒性，临床可见其诱发犬猫癫痫，因其口服生物利用率低，通常采用静脉给药。
2.1.4.2 临床应用
Karayannopoulou等[18]以5-氟尿嘧啶和环磷酰胺联用对8只Ⅲ期乳腺肿瘤患犬进行术后辅助化疗，其无病间期和存活时间相较于单纯手术治疗组有显著提升，表明5-氟尿嘧啶在CMT治疗中也具有进一步探索的空间。
2.1.5 吡罗昔康
2.1.5.1 药理性质
吡罗昔康属于非甾体类抗炎药物(NSAID)，为非选择性环氧合酶抑制剂(cyclooxygenase，COX)，最初用于风湿及类风湿性关节炎的治疗。在早期流行病学研究发现长期服用NSAID可预防实体肿瘤的发生，在肿瘤患者的检测中也发现NSAID的作用靶点环氧合酶-2 (cyclooxygenase-2，COX-2) 在结肠癌、前列腺癌、肺癌以及乳腺癌等多种肿瘤中均有稳定表达, 但在大多数正常组织中并不存在[19]。吡罗昔康抗癌活性的确切分子机制尚不明确，目前研究显示其抗癌途径主要在于抑制肿瘤血管的生成和肿瘤细胞的侵袭转移，以及诱导肿瘤细胞凋亡[20]。该药口服吸收良好，不良反应主要包括胃肠道反应、骨髓抑制及肝毒性，一般而言毒性较小。
2.1.5.2 临床应用
Souza等[21]曾对传统化疗和吡罗昔康的犬炎性乳腺癌(canine inflammatory mammary carcinoma，CIMC)治疗效果进行比较，在此研究中所有接受吡罗昔康的患犬的临床状况和疾病稳定性均得到改善，其无进展生存期也显著高于接受DOX治疗的犬只。CIMC在临床中较为罕见，该肿瘤局部侵袭性高，对治疗反应差，推广吡罗昔康在CIMC中的临床应用可以有效改善患犬预后及生存质量。
2.1.6 去氨加压素
2.1.6.1 药理性质
去氨加压素(desmopressin acetate，DDAVP)是一种具止血特性的加压素肽类似物，于1966年首次合成。因其与血管加压素化学结构相近，能够竞争性阻滞加压素受体，具有降低血压、减轻心脏负担的作用，还可增加凝血因子Ⅷ的活性，加强凝血效应。目前认为该药主要通过增强止血以及促进肿瘤残留组织的快速包膜而防止乳腺癌细胞聚集，并避免其在手术过程中进入脉管系统而实现抗肿瘤细胞转移[22]。
2.1.6.2 临床应用
Hermo等[23]研究表明，围手术期给予DDAVP可最小化残留乳腺癌细胞的扩散和存活，尤其在二级或三级癌症治疗中可显著延长母犬的无病生存期和总生存期。DDAVP有极大的潜力成为CMT手术辅助治疗候选药物，在手术治疗作为CMT首选疗法而术后转移率居高不下的临床背景下具有极大的应用价值。
2.1.7 盐霉素
盐霉素(salinomycin)为聚醚类离子载体抗生素，可改变细胞渗透压，使细胞获得去极化而发生崩解。该药于1968年首次合成，在兽医临床中广泛用于鸡球虫病防治。近年研究发现，盐霉素可杀灭多种耐药肿瘤细胞以及多种肿瘤干细胞，亦可通过诱导肿瘤自噬抑制乳腺肿瘤的侵袭和转移[24]。杜宏超[25]对犬乳腺癌细胞进行盐霉素体内体外试验，发现其可阻碍犬乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移，对犬乳腺癌干细胞的癌干细胞特性亦具有抑制作用，其抗癌活性可能与细胞周期阻滞、细胞凋亡及Wnt-catenin信号通路下调相关。盐霉素作为成熟应用于家禽养殖业的抗生素，价格低廉，副作用较少，投入CMT治疗具有重大优势。
2.2 靶向治疗药物
近年来酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKI) 因在恶性肿瘤靶向治疗中成效卓越、耐受性良好而受到人医临床研究的广泛关注，兽医领域也开始酪氨酸激酶靶向疗法也被用于犬猫恶性肿瘤治疗。该类药物在细胞水平上与致癌位点特异性结合，抑制酪氨酸激酶受体家族，可避免损伤正常组织细胞，具有疗效显著，复发率低，副作用小等诸多优势。
2.2.1 磷酸妥拉尼布
磷酸妥拉尼布(toceranib phosphate)为受体酪氨酸激酶抑制剂(receptor tyrosine kinases inhibitor, RTKI)，商品名为帕拉丁，是目前兽医临床中应用最广泛的TKI药物。该药可作用于细胞表面的血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor, VEGFR)、血小板衍生生长因子受体 (platelet-derived growth factor receptors, PDGFR)、干细胞因子受体(stem cell factor receptor, SCFR)、集落刺激因子-1(colony stimulating factor-1 receptor, CSF-1)、FMS样酪氨酸激酶3(FMS like tyrosinekinase 3, Flt-3)等一系列酪氨酸激酶，通过杀灭肿瘤细胞及切断肿瘤血液供应实现抗肿瘤活性[26]。磷酸妥拉尼布的安全性与有效性经过了临床验证，在接受观察的16只癌症患犬的总有效率达到28%。后续试验中该药相较于安慰剂极大缩短了肿瘤进展时间(time to tumor progression，TTP)，其副作用主要包括腹泻、食欲减退、跛行、体重减轻及便血[27]。磷酸妥拉尼布口服制剂(palladia®; Zoetis, Madison, NJ)于2009年被FDA批准用于治疗复发性、不可重复的二级和三级犬肥大细胞瘤(canine mast cell tumor，CMCT)，成为世界上第一种专门用于治疗犬类癌症的药物。该药的疗效与耐受性经长期临床使用得到验证，在犬乳脉癌治疗中具有潜在的应用价值。
2.2.2 伊马替尼
伊马替尼(imatinib)为目前兽医临床应用最为成功的TKI药物，其作用靶点包括Kit、Abl和PDGFR。最初该药被设计用于阻断慢性髓系白血病患者体内的酪氨酸激酶BCR-ABL融合基因，临床实验中对慢性髓系白血病患者缓解率接近95%[28]。在一项21只MCT患犬的临床试验中，48%的患犬(10只)在接受两周治疗后出现了完全缓解(completeresponse, CR)或部分缓解(partialresponse, PR)，使用该药可能诱发部分犬的肝毒性。甲磺酸伊马替尼口服制剂Gleevec(imatinib mesylate, Novartis, Basel, Switzerland)已被批准用于犬猫肥大细胞瘤(MCT)及肉瘤的治疗，在犬猫肿瘤化疗中得到广泛应用。张苑珑等[29]将多烯紫杉醇与甲磺酸伊马替尼联合应用人乳腺癌细胞株MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型，提高了多烯紫杉醇抑瘤活性。表明其有潜力作为乳腺癌辅助治疗药物，在CMT治疗中具有潜在价值。
2.2.3 马赛替尼
马赛替尼(masitinib)可影响肥大细胞的增殖、分化和脱颗粒以及其相关介质的释放，并通过抑制MCs c-KitR抗血管生成途径而抑制肿瘤生长。兽用马赛替尼(masivet®)是首个获欧盟批准用于治疗无法切除的CMCT的抗癌药物，Hahn等[30]曾对肥大细胞瘤患犬进行马赛替尼临床Ⅲ期试验，发现该药可显著提高患犬生存率，且具有可靠安全性。马赛替尼曾被证明可作为化学增敏剂增强吉西他滨在人胰腺癌中的抗增殖作用[31]。Thamm[32]对犬乳腺癌细胞系进行马赛替尼与其他化疗药物的联合试验，亦发现该药可诱导长春碱和吉西他滨产生强致敏作用，增强其抑制犬乳腺癌细胞的能力。马赛替尼还可同其他化疗药物产生协同作用，以减弱不良反应，增强药效，极其适用于犬乳腺癌治疗。马赛替尼在犬乳腺癌中的推广可有效促进宠物肿瘤靶向治疗的发展。
2.2.4 CDK4/6抑制剂
细胞周期蛋白依赖性激酶4和6(cyclin-dependent kinase 4/6，CDK4/6)抑制剂是目前最受关注的针对人激素受体阳性(HR+)转移性乳腺癌的药物。CDK4/6抑制剂为细胞周期机制以及细胞增殖的关键调节剂，由于细胞周期失调导致的细胞增殖失控是癌症的标志， CDK抑制剂被测试为潜在的治疗剂。CDK4/6抑制剂可通过选择性抑制CDK4/6，恢复细胞周期控制，阻断肿瘤细胞增殖[33]。在人医临床中CDK4/6抑制剂palbociclib、ribociclib和abemaciclib被作为突破性的乳腺癌治疗药物投入了临床试验，结果显示其可显著改善HR+转移性乳腺癌的无进展生存期。目前已有palbociclib(PD0332991，ibrance)、ribociclib(LEE011，KISQALI)以及abemaciclib(LY2835219，Verzenio)3个CDK4/6抑制剂获得FDA批准先后上市，中国FDA也已批准了abemaciclib联合芳香化酶抑制剂用于绝经后HR+/HER2-局部晚期或转移性乳腺癌患者的一线治疗。但CDK4/6抑制剂在研究中存在肿瘤耐药问题，其耐药机制复杂多样，主要包括细胞周期特异性机制及细胞周期非特异性机制[34]。
不论组织类型或等级，在CMT细胞中均可检测到CDK6，提示CDK4/6抑制剂具有潜在CMT治疗价值。Schoos等[35]采用palbociclib处理具有内源性CDK4/6共表达的两种CMT细胞系P114和CF41细胞，可诱导细胞周期停滞，并抑制细胞迁移活性，进一步揭示了该类药物在CMT治疗中的应用前景。针对CDK4/6抑制剂的临床试验有待开展，如体内试验取得良好结果，该药将为CMT靶向疗法开辟新的方向。
对以上抗犬乳腺肿瘤药物进行归纳，详见表1。
表1 潜在抗犬乳腺肿瘤药物
2.3 其他药物
目前在常规化疗药物之外，仍有大量其他类型药物有望用于CMT的辅助治疗。卵巢激素的暴露为CMT发病的重要风险因素之一，孕激素诱导犬乳腺合成生长激素(GH)与生长激素受体(GHR)表达的过程可能会促使CMT发生，利用激素调控类药物可降低雌性激素对犬乳腺癌细胞的刺激，有助于增强其他药物的治疗效果。他莫昔芬(tamoxifen，TAM)为雌二醇受体拮抗剂，可同乳腺细胞雌激素受体(ER)竞争性结合，作为最常用的选择性ER调节剂用于人类乳腺癌患者内分泌治疗，目前已投入CMT临床前试验，同类药物的研发为今后犬乳腺肿瘤的激素辅助治疗开拓了更多可能[36]。血糖调节药物二甲双胍[37]和解热镇痛药物阿司匹林[38]在体外增殖试验中对犬乳腺癌细胞有一定抑制作用，亦为CMT的治疗提供了新的方向。
相较于美国等发达国家，我国犬只绝育率较低导致我国犬乳腺肿瘤发病率较高，当前国内宠物的老龄化趋向也促使发病率、恶变率呈上升态势。临床数据显示，欧美国家成年犬的首要死亡原因为肿瘤疾病[39]。因此，宠物犬的肿瘤疾病的防治是当今宠物临床医学发展中的重要方向之一，发掘潜在抗肿瘤化合物并将其开发为临床有效的抗肿瘤药物是当下宠物药物研发的热点和难点。随着我国农业农村部相继出台诸多促进宠物经济发展的利好政策，加之宠物临床医学的快速高质量发展，开发出宠物专用抗肿瘤药物是解决宠物临床诊疗药物短缺的重要途径。
为解决宠物乳腺肿瘤药物研发中的难点，需注意以下几个方面。首先，利用现有人类抗乳腺肿瘤药物资源，筛选具有潜在抗犬乳腺肿瘤活性的小分子化合物，利用化学结构改造、剂型改良等技术手段加快其兽医临床转化；
第二，基于犬乳腺肿瘤发病机制，设计筛选新型抗肿瘤活性分子，进而推动犬乳腺肿瘤专用靶向药物的研发；
第三，免疫治疗在人类肿瘤疾病中显示出较大优势，基于肿瘤免疫学研究进展，开发犬乳腺肿瘤的免疫治疗药物，可提升治疗效果降低毒副作用；
第四，犬乳腺肿瘤的治疗仍需要开发辅助药物，如免疫增强剂、激素调控剂等有助于患犬快速康复的药物同样值得研发机构重视。