谢蓝田，阮桂仁，刘晓清，张丽帆，张月秋，邱志峰，侍效春
1中国医学科学院北京协和医学院临床医学2015级，北京 100730 2中国医学科学院北京协和医院感染内科，北京 100730
全球范围内，结核病是仅次于新型冠状病毒肺炎的第二大单一感染源致死原因。世界卫生组织数据显示，结核分枝杆菌感染者约占全球总人口的1/4，2021年约160万人死于结核病[1]。中国的结核病发病率居全球第3位，2021年新增结核病患者占全球新发病例的7.4%，提示我国结核病防治任重道远。虽然全人群对结核分枝杆菌普遍易感，但是否发生结核病取决于多种因素，而机体免疫状态为其中的重要方面。自1985年Beck等[2]发现肺结核患者外周血CD4+T淋巴细胞计数呈降低趋势后，国内外多个团队针对结核病患者淋巴细胞亚群特点进行了广泛探索。目前活动性结核病(active tuberculosis, ATB)患者CD4+T淋巴绝对值较健康人群显著减少已达成共识，但其CD8+T淋巴细胞绝对值、CD4/CD8比值、自然杀伤(natural killer，NK)细胞与B细胞绝对值以及各项淋巴细胞亚群所占比例尚未形成一致结论，且既往相关研究普遍样本量较小，研究结果易存在偏倚[3-4]。本研究基于相对较大的样本数据，探究ATB患者外周血淋巴细胞亚群变化特点及其意义，以期为该病的病因学研究及临床诊疗提供参考依据。
1.1 研究对象
本文为回顾性病例对照研究。其中病例组来自2012年6月—2022年1月北京协和医院住院的ATB患者。对照组来自2019年3月—2022年5月北京协和医院体检健康且年龄、性别与ATB患者相匹配的健康人群。根据结核分枝杆菌感染部位，有病原学证据的ATB可分为单纯肺结核、单纯肺外结核、肺结核并肺外结核3类。ATB诊断标准：(1)病原学确诊：肺结核患者住院期间满足中华人民共和国卫生行业标准《肺结核诊断(WS288-2017)》[5]中“痰涂片阳性肺结核诊断”“仅分枝杆菌分离培养阳性肺结核诊断”“分子生物学检查阳性肺结核诊断”中的任一项，肺外结核患者体液、组织活检、引流或冲洗液等任一标本抗酸染色阳性，或结核分枝杆菌培养阳性，或分子生物学检查证明存在结核分枝杆菌。(2)临床确诊：组织活检病理具有典型的结核病特点或具有符合结核病的临床/影像学表现且抗结核治疗有效，其中肺结核患者的典型组织活检病理表现、体征及影像学特征参照《肺结核诊断(WS288-2017)》[5]；
肺外结核的临床表现及影像学特征由临床医师及影像学医师确定。ATB患者纳入标准：(1)符合ATB诊断标准；
(2)本次病程抗结核治疗前或开始抗结核治疗1周内进行淋巴细胞亚群检测者。排除标准：淋巴细胞亚群检测指标存在明显缺失。
健康人群纳入标准：(1)无发热、纳差、乏力、咳嗽、胸痛、咯血等不适；
(2)胸部影像学(X线或CT)未见明显异常；
(3)进行淋巴细胞亚群检测者。排除标准：(1)病历记录或本次体检提示恶性肿瘤、严重的实质器官损伤；
(2)长期使用激素、免疫抑制药物及生物制剂；
(3)有近3个月内任意急性病患病史。
本研究已通过北京协和医院伦理审查委员会审批(审批号：I-22PJ643)，并豁免研究对象知情同意。
1.2 研究方法
通过ATB患者电子病历以及健康人群电子体检报告收集两组临床资料，包括：(1)一般资料：年龄、性别、糖尿病等；
(2)ATB患者病情特征：病程、结核病部位、合并症、是否应用免疫抑制药物等；
(3)实验室指标：血常规、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、淋巴细胞亚群等。比较ATB患者与健康人群、病原学确诊ATB与临床确诊ATB、不同受累部位的病原学确诊ATB患者各项指标差异。
1.3 样本量估算
结合既往研究及临床观察，假设ATB患者CD4+T细胞百分比为61%，健康人群为69%，方差为11%，两组人群为1∶1。在检验水准α为0.05，把握度为0.9的标准下，经计算两组所需最低样本均约40例。
1.4 统计学处理
采用SPSS 26.0.0 软件进行统计学分析。血红蛋白、CD4+T淋巴细胞百分比等正态分布计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验或方差分析；
年龄、血小板计数、淋巴细胞计数等不符合正态分布的计量资料以中位数(四分位数)表示，组间比较Mann-WhitneyU检验或Kruskal-WallisH检验。性别、糖尿病等计数资料以频数(百分数)表示，组间比较采用卡方检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2.1 一般临床资料
共入选符合纳入与排除标准的ATB患者212例、健康人群200例。ATB患者中，临床确诊82例、病原学确诊130例(包括单纯肺结核77例、单纯肺外结核21例、肺结核并肺外结核32例)；
合并肾衰竭3例、人类免疫缺陷病毒感染1例、普通变异型免疫缺陷病1例、活动性乙型肝炎1例、肾移植2例、恶性肿瘤10例；
使用免疫抑制药物51例；
中位病程2(1，6)个月。
相较于健康人群，ATB患者白细胞计数、中性粒细胞计数及百分比、CRP均升高，血红蛋白降低(P均<0.05),见表1。
表1 ATB患者与健康人群一般资料比较
2.2 ATB患者外周血淋巴细胞亚群变化
相较于健康人群，ATB患者淋巴细胞、B细胞、NK细胞计数及其百分比，T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、纯真CD4+T淋巴细胞、记忆CD4+T淋巴细胞、CD28+CD4+T淋巴细胞、CD28+CD8+T淋巴细胞计数等均降低(P均<0.05)，T淋巴细胞百分比、CD8+T淋巴细胞百分比、记忆CD4+T淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞比值、CD38+CD8+T淋巴细胞/CD8+T淋巴细胞比值等均升高(P均<0.05),见表2。
表2 ATB患者与健康人群外周血淋巴细胞亚群比较
2.3 病原学确诊与临床确诊ATB患者外周血淋巴细胞亚群差异
相较于临床确诊ATB患者，病原学确诊ATB患者淋巴细胞、B细胞、NK细胞、T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、记忆CD4+T淋巴细胞、纯真CD4+T淋巴细胞计数等均降低(P<0.05)，提示病原学确诊ATB患者淋巴细胞及淋巴细胞亚群整体呈更低的状态，见表3。
2.4 不同受累部位病原学确诊ATB结核患者外周血淋巴细胞亚群差异
相较于单纯肺结核，单纯肺外结核[4.0(2.5，9.5)个月比2.0(0.9,4.8)个月,P=0.008]、肺结核并肺外结核[3.5(1.5，11.0)个月比2.0(0.9,4.8)个月,P=0.008]患者病程均延长。相较于单纯肺结核患者，肺结核并肺外结核患者B细胞计数降低，单纯肺外结核患者NK细胞百分比升高(P均<0.05)。3组外周血淋巴细胞亚群其他指标均无显著差异(P均>0.05)，见表4。
表4 不同受累部位的病原学确诊ATB患者外周血淋巴细胞亚群比较
虽然结核病患者的淋巴细胞功能呈减低状态已得到公认，但外周血淋巴细胞亚群变化特征在不同研究中并不一致[3-4]。本研究基于北京协和医院长期随访的212例ATB患者，描述性分析了结核病患者外周血淋巴细胞亚群变化特点及其意义，结果显示，相较于健康人群，ATB患者淋巴细胞、B细胞、NK细胞计数及其百分比等多项淋巴细胞亚群指标均降低，而T淋巴细胞百分比、CD8+T淋巴细胞百分比、记忆CD4+T淋巴细胞/CD4+T淋巴细胞比值、CD38+CD8+T淋巴细胞/CD8+T淋巴细胞比值等升高(P均<0.05)；
在不同确诊方式以及受累部位ATB患者组间比较中，亦发现部分淋巴细胞亚群指标存在差异性表达，为了解结核病发病机制提供了一定理论基础。
免疫状态是机体抵御包括病毒在内的多种病原体侵袭的重要防卫力量和最有效武器。结核分枝杆菌为机会性致病菌，机体免疫力降低是结核分枝杆菌感染和结核病发生的重要诱发因素。研究发现，糖尿病、长期使用激素或免疫抑制剂人群发生结核杆菌感染的风险较一般人群增高，而人类免疫缺陷病毒感染、器官移植、肾功能衰竭时合并ATB的风险可增高数十倍[6]。本研究结果显示，ATB患者中合并肾衰竭3例、肾移植2例、恶性肿瘤10例、使用免疫抑制药物51例，合并糖尿病的比例显著高于健康人群(17.9%比7.0%，P=0.001)，基本符合既往报道。
3.1 ATB患者淋巴细胞亚群变化及意义
淋巴细胞亚群可通过多种途径参与机体对结核分枝杆菌的免疫反应，其水平变化特征与感染状态及机体免疫状况密切相关。既往研究显示，结核病患者T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、B细胞及NK细胞计数均低于健康人群，而CD8+T淋巴细胞计数则可降低或与健康人群无显著差异[2, 4, 7-9]。关于T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞等淋巴细胞亚群百分比变化趋势，在既往研究中则无一致结论[10-12]。本研究结果显示，ATB患者T淋巴细胞、B细胞、NK细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞计数均显著低于健康人群，基本符合既往报道结果，再次验证了结核病患者免疫功能呈损伤状态的结论，但ATB患者CD4+T淋巴细胞百分比、CD8+T淋巴细胞百分比并未显著下降。An等[13]研究发现，虽然结核病患者淋巴细胞亚群整体呈降低状态，但各指标的百分比与绝对值下降幅度不平行，淋巴细胞亚群计数低于正常范围的患者较多，而百分比低于正常范围的患者相对较少。本研究观察结果亦呈现类似的变化趋势。
目前，淋巴细胞亚群功能及其确切作用机制与ATB相关性的研究仍缺乏全面了解。已有研究表明，艾滋病进展及丙型肝炎病毒/人类免疫缺陷病毒共感染与CD28+CD4+T淋巴细胞、CD28+CD8+T淋巴细胞缺乏有关[14-15]。Luo等[4]研究发现，与结核潜伏感染者及健康人群比较，ATB患者CD28+CD4+T淋巴细胞、CD28+CD8+T淋巴细胞百分比均无显著变化，而本研究结果呈现为ATB患者CD28+CD4+T淋巴细胞、CD28+CD8+T淋巴细胞计数均较健康人群降低的状态，与之不相符。CD28是T淋巴细胞表面表达的共刺激分子，具有活化T淋巴细胞的作用，但CD28+T淋巴细胞与结核分枝杆菌感染免疫应答的相关性仍不清晰。既往研究对于活化淋巴细胞亚群百分比(CD8DR+T淋巴细胞与CD38+CD8+T细胞)在结核病患者中的变化情况及其临床意义亦未达成一致结论[3, 13]。本研究结果发现，ATB患者CD8+T淋巴细胞百分比升高，CD38+CD8+T淋巴细胞计数及其在CD8+T淋巴细胞中的占比均升高，CD8DR+T淋巴细胞计数虽降低但其在CD8+T淋巴细胞中的占比亦升高，体现了机体受结核分枝杆菌感染刺激后CD8+T淋巴细胞明显活化以抵御细菌的状态。CD38为细胞膜上的小分子糖蛋白，参与T细胞活化，CD38+T淋巴细胞增多被认为与诱导CCR5过表达有关，可促进人类免疫缺陷病毒侵入CD4+T淋巴细胞及病毒复制[16]，其在结核病进展中的作用尚未明确。此外，本研究ATB患者中，记忆CD4+T淋巴细胞在CD4+T淋巴细胞中的占比升高，而纯真CD4+T淋巴细胞在CD4+T淋巴细胞中的占比减少，考虑到记忆T细胞通常在接触抗原后产生，而本研究纳入的ATB患者中位病程为2个月，推测结核发病2个月后足以产生大量针对结核分枝杆菌的记忆细胞。
3.2 不同确诊方式以及受累部位ATB患者淋巴细胞亚群变化
有研究显示，病原学确诊结核患者淋巴细胞亚群与无病原学证据确诊结核患者无显著差异[13]。本研究结果显示，病原学确诊ATB患者淋巴细胞、B细胞、NK细胞、T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞计数等均较临床确诊ATB患者降低，提示病原学确诊ATB患者淋巴细胞亚群整体呈更低的状态，推测淋巴细胞数量相对充足与维持较低的分枝杆菌负荷具有相关性。病原学确诊患者CD38+CD8+T淋巴细胞在CD8+T淋巴细胞中的占比升高，可能与机体反馈性刺激T淋巴细胞活化相关。
关于受累部位，既往研究发现单纯肺结核、单纯肺外结核、肺结核并肺外结核患者的淋巴细胞、T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞百分比及计数无显著差异[11-12,17]。本研究支持上述结果，并发现不同感染部位结核患者的记忆CD4+T淋巴细胞、纯真CD4+T淋巴细胞、记忆CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞及活化CD8+T淋巴细胞亚群计数及百分比亦无显著差异，推测虽然受累部位不同，但均可引起基本相当的免疫反应。本研究结果亦显示，相较于单纯肺结核，肺结核并肺外结核患者B细胞计数降低，单纯肺外结核患者NK细胞百分比显著升高，提示虽然既往研究多认为T淋巴细胞在抗结核分枝杆菌感染中起主要作用，但B细胞可能与肺外结核病情进展相关；
在免疫反应中，NK细胞发挥免疫监视的作用，可直接杀伤病原体，结核分枝杆菌感染后大量NK细胞集中于肺部，进而使血液中其含量减少可能是单纯肺结核患者外周血NK细胞百分比降低的原因之一。
本研究局限性：(1)ATB患者与健康人群的临床资料主要来源于病历记录或体检报告，部分人群的淋巴细胞亚群指标存在缺失。(2)健康体检者仅在年龄、性别构成上与ATB患者进行了匹配，ATB患者可能存在肾衰竭、病毒感染、恶性肿瘤、使用免疫抑制药物等影响淋巴细胞亚群的因素，导致研究结果存在偏倚。(3)未进行多因素分析，难以避免混杂因素的影响。
综上所述，本研究总结了ATB患者外周血淋巴细胞亚群变化特点，发现其存在明显的免疫功能紊乱，表现为淋巴细胞、B细胞、NK细胞计数及其百分比等多项外周血淋巴细胞亚群指标均减少，CD8+T淋巴细胞百分比、CD38+CD8+T淋巴细胞百分比显著升高；
且不同确诊方式及受累部位ATB患者的淋巴细胞亚群亦存在差异。本研究结果有助于揭示ATB患者细胞免疫状态，为该病的病因学研究及临床诊治提供线索。
【方法学点评】
中国医学科学院北京协和医院 侍效春副教授
本文属于病例对照研究。以ATB患者为研究对象，以体检健康人群为对照，采用t检验和方差分析等方法比较了两组人群以及不同方式确诊、不同感染部位ATB患者之间外周血淋巴细胞亚群变化特点，研究结果提示ATB患者存在明显的免疫功能紊乱，其外周血淋巴细胞亚群多项指标整体较对照人群呈减低状态。
首先，研究设计合理、样本量较大，研究结果可信。其次，作为一项病例对照研究，在选取对照时，作者采用了年龄、性别相匹配的方式，初步排除了此两种常见因素对机体淋巴细胞亚群的影响。但鉴于回顾性研究信息收集存在的局限性，未能对体质量指数、肝肾功能、营养状况等基线资料进行匹配和呈现，无法平衡其导致的偏倚。最后，本研究仅描述了淋巴细胞亚群异常与ATB疾病状态的相关性，但究竟是ATB造成了这些免疫指标的变化，还是由于免疫异常而促进了该病的发生，此种因果关系暂无法明确。病例对照研究作为一种简单易行的分析方法，可同时对多种感兴趣因素与疾病的关联性进行评估，特别适合探索性研究，可为病因学分析提供线索和指导。
作者贡献：谢蓝田负责研究设计、数据分析及论文初稿撰写，阮桂仁、刘晓清、张丽帆、张月秋提出修改意见；
邱志峰提供化验结果；
侍效春负责论文修改及定稿。
利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突
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