孙志红，于 琦，杨思远，孙 焱
肝硬化是由某种病因激发的，其组织学特征为肝组织细胞弥漫性纤维化、假小叶和再生结节［1］。肝硬化在全球的发病率逐年上升，我国为肝硬化的高发地区。肝硬化临床发病率高，危害大。除肝移植外，目前西医并无治疗肝硬化的切实办法，常采用保肝、抗病毒等疗法，但治疗费用高昂，患者长期用药易产生抗药性，也会损伤患者的消化系统功能，加重其肝肾负担，疗效不佳［2-3］。中医根据肝硬化的临床症状将其纳入“胁痛”“积聚”“黄疸”“鼓胀”的范畴［4］。中医整体施治、审证求因，其活血散瘀、化枢散结、养阴解毒等法［5］在抗肝硬化治疗中已取得一定疗效［6］。
柴胡归肝经，在治疗肝病方面已有悠久历史，柴胡类方也是《伤寒论》中的经典方剂。柴胡别称山菜、地熏、茈胡，性微寒，味苦且辛［7］。《神农本草经》云：“柴胡，可主心腹，去肠胃中结气”［8］。已有研究表明柴胡有解除肝气瘀滞、抗癌、抗纤维化的疗效［9］。柴胡治疗肝硬化在中医领域已有应用，但目前国内研究多注重临床观察、病例展示，分子层面的理论支持较为欠缺，药效物质基础不清晰，治疗机制不透明，因而柴胡治疗肝硬化的方案临床采用率较低，不利于中医药现代化健康发展。
网络药理学是根据“疾病-基因-靶点-药物”间的作用关系，运用已有的基因库、蛋白库、疾病库、药物库等数据库的相关信息，结合从实验中获取的图谱信息，使用专门的网络软件及相应的算法，具体清晰地揭示疾病与疾病、疾病表型与靶点蛋白、靶点蛋白与药物、药物与药物间的互作方式，从网络的范畴监控药物对疾病的作用，从而摸索出有效且副作用小的多靶点新药［10-11］。
分子对接是把Pubchem 等三维数据库中的小分子依次置于靶标分子的活性位点，经过持续整合受体化合物的位置、构象、分子内部可旋转键的二面角和受体的氨基酸残基侧链及骨架，探求受体小分子和靶标大分子相互作用的最优组合，并推断其结合方式及亲和力。分子对接可经过一系列函数计算筛选出最贴合的天然构象和受体亲和力最好的配体，是模仿分子间作用的方法［12-13］。分子对接技术缩短了药物开发周期，具有快速、精确度高的特点，在药物研发领域大有作为，是先导化合物发掘和不断优化的实用工具［14］。
本文运用网络药理学方法并结合分子对接技术从分子层面详细探究柴胡治疗肝硬化的作用机制，为进一步明确柴胡治疗肝硬化的作用机制提供理论支持，以期为今后肝硬化的治疗研究提供新的思路。
1.1 数据来源
在中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Database and Analysis Platform，TCMSP）以“Herb name=chaihu”为检索词获取柴胡的全部有效成分，设置药物筛选标准口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug-likeness，DL）≥0.18，移除不合格成分，得到可药用成分信息。
1.2 研究方法
网络药理学是系统且成熟的研究方法，可多靶点、多组分地将药物靶点与疾病靶点相联系，全面揭示药物的作用机制。因而，本文运用网络药理学方法对柴胡治疗肝硬化的成分及靶点进行分析归纳，通过系统的分析方法筛选出核心靶点，探究其治疗肝硬化的作用机制。
1.2.1 筛选柴胡治疗肝硬化的作用靶点
通过GeneCards 数据库和DisGeNet 数据库筛选出肝硬化关联靶点，移除重叠靶点，得到肝硬化靶点信息。基于Venny 2.1.0 在线数据库对肝硬化靶点和柴胡作用靶点取交集，获得柴胡和肝硬化的共同靶点。
1.2.2 初步构建“化合物-靶点”网络
将筛选出的有效成分及靶点数据导入Cytoscape 3.8.2 软件，计算拓扑学参数并且构建“柴胡活性化合物-肝硬化靶点”关系网络，然后进行可视化分析。
1.2.3 构建PPI 网络，筛选核心靶点
将柴胡和肝硬化的共同靶点导入在线数据库STRING 进行分析，生成蛋白相互作用网络（Protein-protein Interaction Network，PPI）。利用Cytoscape 3.8.2 软件中的CytoNCA 插件及其算法程序筛选出核心靶点，构建核心子网络。
1.2.4 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析
基于DAVID 在线数据库对靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，使用R 程辑包（ggpubr、tidyr、stringr、ggplot2）对富集结果进行可视化分析，设置p＜0.05 为阈值，筛选符合条件的前20 位KEGG信号通路及GO 生物过程。
1.2.5 分子对接
对通过PPI 拓扑网络筛选出的核心基因与其对应活性成分进行分子对接。在Pubchem 数据库检索出柴胡有效成分的二维结构，将其导入ChemBio 3D Ultra v14.0.0.117 软件转换为三维结构。使用蛋白质结构数据库（Protein Data Bank，PDB）查找核心靶蛋白，将其导入Pymol 2.4.1 软件解除水分子及其原有配体。Pymol 2.4.1 是蛋白质可视化软件，可以多角度展示蛋白质的不同形态，并对其进行操作。将柴胡有效成分的三维结构和去除水分子及配体的核心靶蛋白导入AutoDockTool 1.5.6 软件进行分子对接。
2.1 柴胡的成分及相关靶点
通过检索柴胡的有效成分发现，柴胡中有349种活性成分，将阈值调整为OB≥30%，DL≥0.18，共得到山柰酚（Kaempferol）、乙酸芳樟酯（Linoleyl acetate）、槲皮素（Quercetin）、豆甾醇（Stigmasterol）、茵陈黄酮（Areapillin）、黄芩苷（Baicalin）、异鼠李素（Isorhamnetin）等17 种成分，详细信息见表1。这17 种成分分别作用于194 个靶点，其中部分靶点的Uniprot 编号、靶点名称、基因名称信息见表2。
表1 柴胡有效成分基本信息
续表1
表2 柴胡有效成分作用靶点（部分）
2.2 “柴胡活性化合物-肝硬化靶点”关系网络构建
利用GeneCards 数据库和DisGeNet数据库查找肝硬化相关的编码基因，获得肝硬化相关靶点4 754 个。基于Venny 2.1.0 在线软件绘制韦恩图的功能，对柴胡的194 个药物潜在靶点和肝硬化的4 754 个靶点取交集，得到159 个共同靶点，如图1 所示。这159 个靶点既是肝硬化相关的靶点，也是柴胡治疗肝硬化的作用靶点。将共同靶点和活性成分导入Cytoscape 3.8.2 软件进行可视化分析，得到“肝硬化-柴胡活性化合物”网络图（图2）。其中外围黄色部分表示共同靶点，红色部分表示药物活性成分。
图1 “肝硬化-柴胡靶点”韦恩图
图2 “肝硬化-柴胡活性化合物”网络图
2.3 PPI 网络构建及核心靶点筛选
将159 个共同靶点导入STRING 在线数据库中，设置物种为Homo Sapiens，得到PPI 网络图，展示了靶点间的相互作用关系。该网络共有157 个节点（2 个靶点未被系统纳入），2 963 条边，见图3。将PPI 网络的TSV 文件导入Cytoscape 3.8.2，利用Cytoscape 3.8.2 中的CytoNCA 插件进行拓扑结构分析，根据插件算法在这157 个节点中筛选出连通性、紧密度、特征向量、中间度均靠前的15 个节点，利用这15 个节点构建出核心靶点网络，过程见图4。筛选出的15 个核心靶点既受柴胡活性化合物的调控，也与肝硬化的发病密切相关，详细信息见表3。
表3 “柴胡治疗肝硬化核心基因”详细信息
图3 “柴胡治疗肝硬化靶点作用靶点”PPI 网络
图4 PPI 网络中核心靶点筛选过程
2.4 GO 生物过程和KEGG 通路富集分析
将柴胡与肝硬化的交集基因上传至DAVID 在线数据库进行GO 分析，以p＜0.05、最小计数为3 且富集因子＞1.5 为阈值进行筛选，获得GO 分析结果。利用R 程辑包（tidyr、stringr、ggpubr）将GO 分析结果可视化。依照p值从小到大的次序，选取前20 条GO 分析条目（图5）。具体包括：生物进程（biological process，BP）——细胞表面受体信号通路、病毒过程、子宫内胚胎发育、细胞因子介导的信号通路、t 细胞受体信号通路、对病毒的防御反应、细胞外基质组织、细胞生长的正调控、细胞或亚细胞成分的运动、转化生长因子β 受体信号通路；
细胞组分（cellular components，CC）——黏着斑、神经元胞体、突触、内质网腔、基底外侧质膜；
分子功能（molecular function，MF）——氧化还原酶活性、转录共激活因子活性、蛋白质二聚化活性、铁离子结合、跨膜信号受体活性等。
图5 “柴胡治疗肝硬化作用靶点”GO 富集分析柱状图
经过柴胡治疗肝硬化的靶点KEGG 通路富集分析共获得130 条KEGG 通路，依照p值从小到大的次序筛选前20 条，主要为癌症途径、乙型肝炎、TNF 信号通路、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、美洲锥虫病、非小细胞性肺癌、Hif-1 信号通路、癌症中的蛋白多糖、慢性髓细胞样白血病、弓形体病、结肠直肠癌、小细胞肺癌、甲型H1N1 流感、丙型肝炎、Toll 样受体信号通路、HTLV-I 感染、利什曼病、神经胶质瘤。利用R 程辑包（tidyr、ggplot2）对这些KEGG 通路进行分析及可视化（图6）。
图6 “柴胡治疗肝硬化作用靶点”KEGG 富集分析气泡图
2.5 分子对接及结合能分析
对根据 PPI 拓扑网络筛选出的核心基因（AKT1、TP53、IL6、TNF、VEGFA、JUN、IL1B、CASP3、HIF1A、MYC、EGFR、PTGS2、EGF、MMP9、CCND1）与其对应活性成分（乙酸芳樟酯、山柰酚、槲皮素）进行分子对接，验证柴胡活性成分与靶点的对应关系。一般认为，结合能小于-4.5 kcal/mol表示可以结合，结合能小于-6 kcal/mol 表示结合能力强［15］，其结果见表4。由表4 可见，乙酸芳樟酯与PTGS2、EGF 结合效果较好；
山柰酚与CASP3、JUN、TNF 结合效果较好，与AKT1 可以结合，但结合效果有待进一步研究；
槲皮素与MYC、EGFR、CCND1 结合效果较好，与MMP9可以结合，与TP53、IL6、VEGFA3 结合效果较差。另外，在分子对接过程中发现，靶点HIF1A、IL1B无法与柴胡的活性成分成功对接。靶点分子对接三维图见图7。
表4 柴胡活性成分与核心靶点分子对接结果
图7 “柴胡活性成分与核心靶点”分子对接三维图
21 世纪以来，我国社会经济高速发展，人们的生活结构发生巨变，人口老龄化进程加剧，国民疾病谱出现了很大的变化，心血管疾病、肝肾疾病、肿瘤等慢性复杂病非常突出，已经威胁到了我国人民的生命健康安全［16-17］。这些慢性病及其并发症在发展过程中往往牵涉人体的多个器官、多个信号通路、多个靶点［18］，因此，西方医学“一个靶点、一种疾病”［19］的药物理念已经很难达到很好的疗效。而网络药理学“多基因、多靶点、多通路”及中药“多靶点、多路径、多组分”联合作用［20］，与这些慢性病的治疗理念不谋而合。因此，探究中药多组分、多靶点间的网络关系，在阐述慢性病的发病机制和寻找治疗靶标方面十分必要。
肝硬化是全世界肝病患者死亡的主要病因之一，许多急、慢性肝病最后均可能演化为肝硬化［21］。全世界肝硬化病亡人口从1990 到2013 年上涨40 余万［22-23］。本文运用网络药理学方法构建了柴胡治疗肝硬化的网络图谱，依次分析了其活性成分、调控靶点、生物进程和信号通路，解释了柴胡在治疗肝硬化中的作用。根据PPI 网络筛选出了AKT1、TP53、IL6、TNF、VEGFA、JUN、IL1B、CASP3、HIF1A、MYC、EGFR、PTGS2、EGF、MMP9、CCND1 共15 个靶点度值较高的靶点。结合分子对接结果预测出柴胡治疗肝硬化的关键靶点为PTGS2、EGF、CASP3、JUN、TNF、MYC、EGFR、CCND1。柴胡的有效成分可能是与这8 个关键靶点协同作用的。目前已有研究表明抑制PTGS2 可降低肝脏炎性损伤，PTGS2 可能是治疗肝损伤的关键靶点［24-25］。EGF 促进细胞分裂，与组织的修复再生、癌症的发生有紧密的联系［26］，肝硬化的发生与其存在关联［27］。肝细胞CASP3 在激活NASH 相关的细胞纤维化中有突出作用［28］。JUN 与肝癌的发生密切相关［29］，而在我国，将近85%的原发肝癌有肝硬化病理基础［30］，可以推断JUN 与肝硬化发病机制存在联系［31］。有研究发现，降低血清中的TNF-α、IL-6、IL-8 水平后，肝纤维化的发展受到抑制［32］。MYC 在肝细胞增殖和肝脏肿瘤发生过程中起重要作用［33］。有研究表明，黏着斑激酶磷酸化后，可调控细胞周期蛋白从而促进肝星状细胞增殖，形成肝纤维化。而基因CCND1 参与细胞周期蛋白的编码，若可调控该基因则可调控细胞纤维化进程［34］，肝硬化发病率可得到有效控制。以上资料证明本文筛选出的关键靶点参与肝脏内的多个生物进程，GO 富集分析结果表明，柴胡有效成分的靶点涉及人体内的多个生物进程，参与人体内的多项机体活动，说明用柴胡治疗肝硬化的过程是多靶点、多途径协同作用的。
KEGG 富集结果显示，柴胡治疗肝硬化涉及多条信号通路，主要与癌症途径（51 个靶点参与）、乙型肝炎（35 个靶点参与）、TNF 信号通路（25 个靶点参与）联系密切。乙型肝炎是我国肝硬化的主要病因，每年乙型肝炎发展所导致的肝硬化、肝癌等患者死亡数达26.3 万［35］。研究结果表明参与乙型肝炎的靶点与参与肝硬化的靶点重合率较高，同时参与肝硬化的靶点与参与肝癌的靶点重合率也非常高，证实这两条通路与肝硬化相关。TNF 信号通路在肝硬化的发病机制中发挥作用，有关研究表明位于肝窦内表面的吞噬细胞（KCs）源性TNF-α 的释放增殖可以经TNFR/caspase8 通路诱导肝星状细胞凋亡［36］，且肝星状细胞活跃分化是肝纤维化产生的核心枢纽［37-38］，肝星状细胞启动机制和控制启动的路径研究成为治愈肝纤维化（早期肝硬化）的突破点［39］。
本文通过一系列分析发现，柴胡的有效活性成分有17 种，治疗肝硬化的关键成分有乙酸芳樟酯、山柰酚、槲皮素。目前有研究结果显示乙酸芳樟酯可以调节肝脏中的线粒体功能［40］，而有实验验证保护肝中的线粒体就可以保护肝细胞，抑制肝硬化［41］。山奈酚作用于紧密连接蛋白，能够有效治疗小鼠的肝损伤［42］，而慢性肝损伤患者修复期会出现病理或生理性肝硬化［43］。槲皮素在体内和体外模型中均有抗纤维化活性，且在槲皮素的功能位置添加甲基可强化槲皮素的抗纤维化作用［44］。本文研究结果与上述相符，说明柴胡在治疗肝硬化时具有多成分协作的特点。
近年来，传统医药在医疗领域逐渐发挥重大作用，许多疑难病症通过中医救治都有了很好的疗效。对中药作用机制细化可增强治疗的可信性，有利于中医药更加深远的发展。本文预见了柴胡治疗肝硬化的有效活性成分、靶点、结合形式及相关通路，通过网络药理学给出了多成分、多靶点、多路径的交互关联结果，为研究柴胡的有效成分及肝硬化治疗的机制提供了理论层面的依据。
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