晁江涛，曹建敏，吴新儒，李志远，曹鹏云，崔萌萌，孙玉合*，刘贯山*
烤烟特征香韵品系8号清甜香韵的形成机制研究
晁江涛1,2，曹建敏1，吴新儒1，李志远1，曹鹏云1，崔萌萌1，孙玉合1*，刘贯山1*
（1.中国农业科学院烟草研究所，烟草行业烟草基因资源利用重点实验室，青岛 266101；
2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）
烤烟特征香韵品系8号（特8）是通过EMS诱变中烟100，连续自交选育的烤烟新品系，其现蕾期的上部叶具有明显的清甜香韵。为探讨鲜烟叶香韵的形成机制，以特8和中烟100为研究对象，运用顶空-箭型固相微萃取-气相色谱质谱联用法（HS-SPME Arrow-GC/MS）测定其挥发性成分，结合转录组学方法开展相关研究。结果显示：（1）特8挥发性成分有26种化合物，其中萜烯类化合物数量18种，相对含量均值为71.74%，是中烟100的2.34倍；
（2）特8芳樟醇的相对含量均值为52.12%，为中烟100的3.40倍，是清甜香韵的主体成分；
（3）MVA通路负责合成挥发性萜烯类化合物，特8现蕾期上部叶有9个关键限速酶基因、12个TPS基因上调表达，有助于提高萜烯类化合物的释放量，其中TPS亚家族b成员可能是芳樟醇合酶基因。综上所述，特8现蕾期上部叶的MVA通路存在多个关键基因协同上调，有助于提升其挥发性萜烯类化合物的总体释放量，而具有清甜香味且相对含量最高的芳樟醇可能是赋予其清甜香韵的主效因子。
烟草；
EMS突变体；
清甜香韵；
特8；
萜烯合酶
特8是通过EMS诱变中烟100种子[1]，运用系谱法经定向选育获得的烤烟新品系，该品系自苗期至现蕾期，清甜香特征逐渐明晰，处于现蕾期的嫩叶或侧芽表现尤为明显。随着嫩叶伸展成为成熟叶，清甜香特征逐渐变弱，此进程伴随腺毛脱落，腺毛脱落会直接减少腺毛分泌物的总量。这一现象最初是通过人工嗅闻发现的[2]。但是，该香韵的形成机制尚不明确，例如香韵主要化合物的构成，合成通路及其关键调控基因等。
鲜烟叶与烤后烟叶的香韵特征紧密相关又存在较大差异[3]。鲜烟叶经历一系列复杂的烘烤工艺，大量内含物完成物质转换才能形成烤后烟香韵特征。本课题组前期分析研究了烤烟品种中烟特香301烤后烟叶的特征香气物质[4-6]，该品种具有玫瑰花香韵，其挥发性气体的种类及相对含量以萜烯类化合物为主，玫瑰花香韵的主要组分为β-罗勒烯。除此之外，果香、辛香及萨姆逊香韵突变品系的组成成分，均以萜烯类化合物为主。但是，前期研究未对鲜烟叶中特征香气物质的分子代谢机制深入解析。本研究以清甜香突变品系特8和中烟100鲜烟叶为试验材料，在采用GC-MS非靶标分析技术明确其特征香气物质的基础上，结合转录组学方法，从分子水平和基因水平探索清甜香韵的形成机制。
1.1 试验材料
试验材料为特8和中烟100（对照），种子由中国农业科学院烟草研究所烟草突变体库提供。试验材料于2019年5月1日移栽至山东省诸城洛庄试验站（北纬：35°59′25.20″，东经：119°07′55.37″），7月16日进入现蕾期，开展样品采集相关工作。
1.2 仪器与试剂
气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦科技有限公司）；
自制三角顶空瓶；
固相微萃取（SPME）进样器及50/70 μm DVB/CAR/PDMS萃取头（美国Supelco公司）；
氮吹仪（美国Organomation公司）；
甲醇、三氯甲烷、吡啶（色谱纯，纯度>99.5%），甲氧基胺盐酸盐（纯度>98%）购自上海泰坦科技股份有限公司；
正十七烷醇（纯度>99.5%）,N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟利乙酰胺（MSTFA，纯度>98.5%）购自美国Sigma公司。
1.3 试验方法
1.3.1 挥发性气体采集 依据烟草挥发性气体采集最优条件[7]，顶空采样装置使用硅烷化处理后的自制三角瓶，运用原位静态顶空法采集活体烟株挥发性气体，设8个生物学重复，在实际操作过程中，有3份中烟100样品数据异常，因此中烟100参与后续分析的生物学重复为5个。采集气体前，萃取头需在气相色谱仪进样口老化15 min（进样口温度为250℃）。采集气体时，选取无物理损伤、无病虫害、生长势一致的烟株上部2～3片嫩叶，完全收入三角瓶中。三角瓶整体倒置，萃取头通过瓶底部小孔插入至瓶内，将纤维头伸出针管，静态萃取40 min。完成后，放入冰盒中等待GC-MS上机检测。
1.3.2 GC-MS条件 参考徐晓玲等[7]优化的GC-MS条件：色谱柱为DB-5MS石英毛细管（30 m× 250 μm×0.25 μm），载体为高纯氦气，流速1 mL/min。进样口温度250 ℃，不分流进样。进样时，柱温箱升温程序设置：45 ℃保持2 min，5 ℃ /min的速率升至200 ℃，保持2 min，15 ℃/min升至300 ℃，保持5 min。离子源选用EI源，电离电压70 eV，离子源温度230 ℃，传输线温度250 ℃。全扫描模式，扫描范围33 ～550 （/）。
1.3.3 GC-MS数据分析 GC-MS分析后，各色谱峰与美国国家标准与技术局化学数据库（https://webbook.nist.gov/chemistry/）和Agilent Fiehn代谢组学数据库的标准离子片段进行比对，之后对比辅助保留指数及参考已有文献，最终确定化合物名称。每个挥发性代谢产物的相对含量采用峰面积百分比法表示，用内标法计算内在代谢产物相对含量。挥发性代谢产物分析中，主要针对在DB-5MS色谱柱中保留指数(retention index, RI) < 1700的成分，剔除因萃取头和色谱柱流失导致组内差异较大的成分和空白对照中检出的环境中苯系类化合物等，最终确定26种挥发性代谢产物进行后续分析。由于样品之间变异系数较大，每个代谢产物的相对含量均用最大值、最小值及平均值进行标注，特8与对照之间的差异倍数采用平均值进行计算。
1.3.4 转录组取样 于现蕾期选择天气晴朗的上午8∶30至11∶30之间取样。选取生长势一致的烟株，挂牌标记。采摘靠近烟株顶部，叶片长度15～20 cm左右的嫩叶，迅速打孔，每份样品取5～10个2.5 cm圆叶片。用锡箔纸包裹，做好标记，并用棉绳扎好之后迅速置于液氮中。转录组测序生物学重复默认为3个，另外增加2个重复作为备用样。
1.3.5 转录组测序 用Trizol 法提取待测叶片总 RNA；
使用Illumina公司提供的NEBNext®UltraTM RNA Library Prep Kit 试剂盒构建cDNA文库；
之后邮寄cDNA文库至天津诺禾致源生物科技有限公司，利用Illumina高通量测序平台NovaSeq 6000进行测序。
1.3.6 萜类代谢通路基因检索 通过关键词检索白肋烟TN90基因组注释信息[8]，获得萜类代谢通路关键限速酶候选基因。以Pfam数据库[9]保守结构域PF01397、PF03936 和PF19086为查询序列，运用HMMER[10]（v3.0）检索TN90基因组蛋白注释信息，经校正获得萜烯合酶（terpene synthase, TPS）基因家族。以番茄TPS基因[11]为参考，用MEGA[12]（v11.0.10）软件，基于邻接法（Neighbor-Joining, NJ）构建系统进化树（Bootstrap=1000），利用iTOL在线工具[13]（https://itol.embl.de）美化进化树。
1.3.7 基因表达模式分析 以TN90[8]为参考基因组。用HISAT2[14]（v2.1.0）将转录组比对至参考基因上，利用bedtools[15]（v2.19.1）从中提取基因相对表达量信息，用R语言包DESeq2[16]分析差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）。筛选时，设置表达差异（log2Fold Change，log2）≥1.0, P-value≤0.05。使用TBtools[17]工具包中HeatMap绘制基因差异表达图。
1.3.8 序列比对分析 序列比对使用BLAST（v2.2.26+）工具。其中BLASTN用于核苷酸序列比对，e-value值设为0.05，其余参数默认；
BLASTP用于氨基酸序列比对，e-value值设为0.05，其余参数默认。
表1 特8和中烟100现蕾期上部嫩叶的挥发性气体成分
2.1 挥发性气体成分分析
单一化合物的相对含量采用峰面积百分比法表示，设置差异倍数（Fold Change,）≥2为差异显著。由表1可知，检测到特8挥发性气体26种化合物，其中萜烯类为18种，其他化合物8种，相对含量分别为71.74%、28.26%，整体来看，特8挥发性气体以萜烯类为主，其萜类化合物的相对含量是中烟100的2.34倍；
特8有11种化合物的相对含量平均值≥1%，其中芳樟醇差异水平显著（=3.40，相对含量平均值为52.12 %）。
2.2 萜类化合物代谢通路的基因表达差异分析
研究表明，萜类化合物的释放量与TPS基因的表达量呈正相关[18-21]，其中MVA通路主要负责合成挥发性萜类化合物。本研究围绕MVA通路，筛选特8与中烟100之间的差异表达基因。经检索，MVA通路上游AACT、HMGS、HMGR、MK、PMK、MVD等6个关键限速酶的候选基因数分别为14、6、7、4、2、4，共计37个；
中游IDI、GPPS、FPPS、GGPPS等4个关键酶的候选基因数分别为6、2、4、15，共计27个；
下游TPS基因家族有55个成员，以番茄TPS基因为参考，将其划分为a、b、c、e/f 和g等5个亚家族（图1），其成员数分别为20、18、6、10和1，其中TPS-a和TPS-b主要负责合成倍半萜和单萜化合物。
注：烟草TPS基因前缀为LOC，番茄TPS基因前缀为Sly。
为便于描述MVA通路不同阶段的差异基因，将通路分为上游、中游和下游3个阶段（图2），其中上游负责合成GPP/FPP/GGPP的前体物IPP和DMAPP；
中游负责合成萜烯类化合物前体物GPP/FPP/GGPP；
下游负责直接合成单萜、倍半萜或二萜等萜烯类化合物。由图2可知，从MVA通路中筛选到30个差异表达基因，其中21个基因显著上调，9个基因显著下调。
（1）在通路上游，AACT基因（LOC107806485）、HGMS基因（LOC107796407）、HGMR基因（LOC107765219）及MVD基因（LOC107811776）均显著上调，有助于增强合成IPP和DMAPP的能力。
（2）在通路中游，有3个IDI基因（LOC107808635、LOC107821723和LOC107821727）上调，有助于提升IPP与DMAPP的动态转换效率；
2个FPPS基因（LOC107765018和LOC107795792）上调，1个FPPS基因（LOC107779968）下调，有助于提升倍半萜底物FPP的合成能力；
3个GGPPS基因（LOC107822513、LOC107783257和LOC107830453）下调，可降低通路合成二萜底物GGPP数量，间接为合成GPP和FPP提供更多的原材料。
图2 MVA通路相关基因差异表达分析
（3）在通路下游，有10个TPS-a基因（LOC107760760、LOC107769201、LOC107769393、LOC107778627、LOC107783716、LOC107799408、LOC107812685、LOC107819330、LOC107821548、LOC107829287）显著上调表达，有助于提升合成单萜和倍半萜的水平；
TPS-b有2个基因（LOC107762925和LOC107794877）上调表达，1个基因（LOC107828918）下调，有助于合成更多的单萜；
TPS-c有1个基因（LOC107790102）下调；
TPS-e/f有1个基因（LOC107816701）下调；
TPS-g有1个基因（LOC107828192）下调。
2.3 TPS差异基因功能预测
结果显示，在TPS基因家族中，有17个差异基因（图2）：12个基因上调、5个基因下调；
其中上调明显、表达量较高的基因为LOC107762925 (TPS-b, TPM=48.7)和LOC107829287 (TPS-a, TPM=34.7)。通过与NCBI非冗余蛋白数据库（Non-redundant protein sequences, NR）做BLAST序列比对发现，LOC107762925与绒毛状烟草基因LOC108948581编码的氨基酸序列完全一致，后者已知产物为R-芳樟醇，这表明LOC107762925是芳樟醇合酶候选基因；
而LOC107829287与番茄TPS32基因高度同源，推测该基因为(+)-喇叭烯合酶候选基因。
研究结果表明，特8可检测的挥发性化合物种类比中烟100多6种；
特8萜烯类化合物的相对含量为71.74%，是中烟100的2.34倍；
特8芳樟醇的相对含量均值为52.12%，是相对含量最高的化合物，其香气属性为清甜香味，由此推测芳樟醇是特8品系鲜烟叶具有清甜香韵的主效因子。
鉴于TPS基因的表达量与其产物的释放量正相关[18-21]，基于差异代谢物与差异基因分析结果，或许可从中发现代谢产物与基因之间的关联线索。芳樟醇是相对含量最高、差异显著的代谢产物；
而LOC107762925是表达量较高、差异显著的TPS-b基因。清甜香韵与芳樟醇、芳樟醇与LOC107762925均呈现强相关，三者之间存在密切联系。进一步经过序列比对，LOC107762925与绒毛状烟草基因LOC108948581编码的氨基酸序列完全一致，后者已知产物为R-芳樟醇，可推测LOC107762925是芳樟醇合酶候选基因。
综上所述，推测在特8嫩叶的MVA通路中，多个TPS基因协同上调，显著增加了其烟叶腺毛释放挥发性萜烯化合物的种类及总量，其中芳樟醇为主效因子，其自身的清甜香属性赋予了特8清甜香韵，而LOC107762925是芳樟醇合酶的候选基因，催化底物GPP合成芳樟醇。
具有清甜香属性的芳樟醇赋予了特8品系清甜香韵；
更多种类的萜烯类化合物有助于提升特8清甜香韵的层次感；
TPS基因亚家族b成员LOC107762925是合成芳樟醇的候选基因之一，其功能还需进一步验证。
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Study on the Formation of Fresh-Sweet Flavor in Tobacco Mutant T8
CHAO Jiangtao1,2, CAO Jianmin1, WU Xinru1, LI Zhiyuan1, CAO Pengyun1, CUI Mengmeng1, SUN Yuhe1*, LIU Guanshan1*
(1. Key Laboratory for Tobacco Gene Resources, Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)
T8 is a new flue-cured tobacco mutant line, which was selected from the Zhongyan100 EMS mutant library to have obvious fresh-sweet fragrance at bud stage. In order to comprehensively understand the formation of flavor at the molecular and genetic levels, we analyzed T8 and Zhongyan100 fresh tobacco leaves using the headspace-arrow solid phase micro-extraction and gas chromatography mass spectrometry (HS-SPME Arrow-GC/MS) to detect volatile organic compounds (VOCs), and the results were analyzed in combination with with RNA-seq data. The results showed that: (1) There are 26 kinds of VOCs in T8, among which 18 kinds of terpenes were found, and the relative content of terpenoids was 71.74%, which was 2.34 times of that of Zhongyan100. (2) The relative content of T8 linalool was 52.12%, which was 3.40 times of Zhongyan100, and it was the main component of fresh-sweet flavor. (3) In the MVA pathways of T8 young leaves at bud stage, 9 key rate-limiting enzyme genes and 12 TPS genes were up-regulated, which contributed in increasing the release of terpenoids. In summary, the synergistic up-regulation of several key genes in the MVA pathway contributes to the increase of overall release amount of terpenoids, and linalool with sweet flavor accounts for the highest proportion, which may be the main contributing factor to fresh-sweet flavor.
; EMS mutant; fresh-sweet flavor; T8; TPS
10.13496/j.issn.1007-5119.2022.06.012
TS41+1
A
1007-5119（2022）06-0082-06
中国农业科学院科技创新工程（ASTIP-TRIC02）；
中国烟草总公司山东省公司重点项目（202209）；
中国烟草公司“揭榜挂帅”项目（110202103009；
110202103015）
晁江涛（1985-），男，助理研究员，从事烟草分子育种研究。E-mail：chaojiangtao@caas.cn
，E-mail：孙玉合，sunyuhe@caas.cn；
刘贯山，liuguanshan@caas.cn
2022-06-06
2022-12-05
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