傅传杰，全浩龙，杨 敏，黄建忠
(福建师范大学生命科学学院/工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心，福建 福州 350108)
烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，NMN)是一种自然存在的生物核苷酸，分子式：C11H15N2O8P，分子量：334.2，分为α和β两种结构形式。其中β-NMN(NMN)是烟酰胺单核苷酸的活性形式，天然存在于人体及果蔬肉类当中，参与多种生理生化反应[1-4]，有助于恢复母猪等畜牧哺乳动物的卵巢活力、改善卵母细胞功能[5-7]，在肺炎、溃疡性结肠炎、调节肠道菌群[8-11]等疾病的治疗中作用显著。我国是畜牧养殖大国，随着畜牧养殖业集约化程度越来越高，国家对动物疫病防控越来越重视。2020年7月国家颁布的“禁抗令”无疑是对养殖业的一大挑战，会增加畜禽的发病率以及养殖和医疗成本，预防和治疗用药的需求也日益增多[12]，兽药市场总体呈上升趋势，预计2022年全球兽药市场规模将达5 372亿元[13]。因此NMN有极大的潜力作为饲料添加剂应用于畜牧养殖产业[14]，有助于畜牧产品的食品安全建设。
当前NMN的合成主要分为化学合成法、微生物发酵法以及生物酶法。化学合成法生产过程中使用大量有机溶剂，产物中含有无活性α-NMN，纯化难且环境污染严重[15-16]，因此该方法已逐渐被淘汰。微生物发酵法是在细胞内烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的作用下，将自身生长积累合成的磷酸核糖焦磷酸(PRPP)与培养基外加的烟酰胺(NAM)催化生成NMN。Huang等[17]通过在大肠杆菌中异源表达弧菌噬菌体KVP40(VpNadV)的烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)，以烟酰胺为底物发酵25 h后NMN产量达到16.2 g·L-1，为目前报道的最高产量。发酵法解决了化学合成法中NMN手性问题，但存在发酵液组分复杂，分离纯化困难、成本高的问题[18-19]。生物酶法转化既有效解决化学合成法同分异构体以及存在致癌物残留风险的缺点，也能解决微生物发酵法周期长、纯化难和成本高的问题，但生物酶转化过程中需要等摩尔比ATP提供磷酸，成本高，且反应过程中有大量副产物ADP/AMP生成，不利于后期纯化。因此在多种NRK中筛选表达出一个性能稳定转化效率高的的酶[20-21]，同时降低ATP用量，简化纯化工艺至关重要。为满足未来NMN在药物制备中的应用，本试验通过对4株不同来源的NRK菌株进行筛选，同时在酶转化系统中引入PPK酶构建ATP循环系统，以期提高底物的转化效率，降低ATP的用量以及减少副产物的生成，利于降低生产成本和纯化难度。
1.1 材料和试剂
1.1.1菌株和质粒 本试验中用到的表达宿主EscherichiacoliBW25113、表达载体pBAD，均保藏于福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心。
1.1.2酶和试剂 高保真PCR酶购自南京诺维赞生物科技有限公司；
Gibson酶购自NEB(北京)有限公司；
琼脂糖、凝胶DNA回收试剂盒均购自上海捷瑞生物工程有限公司；
链霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
酵母提取物和胰蛋白胨，英国Oxoid公司。所有试剂均为分析纯。
1.1.3培养基 LB培养基(液体)：酵母浸提粉5 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、氯化钠10 g·L-1，固体培养基另外添加20 g·L-1的琼脂糖。
ZY培养基(液体)：酵母浸提粉5 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、50×M 20 mL·L-1、50×5052 20 mL·L-1、1 moL·L-1硫酸镁2 mL·L-1、1000×微量元素2 mL·L-1、1000×链霉素1 mL·L-1、20%阿拉伯糖10 mL·L-1。50×5052：25%甘油、2.50%葡萄糖。50×M：1.25 moL·L-1磷酸二氢钠、1.25 moL·L-1磷酸二氢钾、2.5 moL·L-1氯化铵、0.25 moL·L-1硫酸钠。1000×微量元素：50 mmol·L-1氯化高铁、20 mmol·L-1氯化钙、10 mmol·L-1氯化锰、10 mmol·L-1硫酸锌、20 mmol·L-1氯化钴、2 mmol·L-1氯化铜、2 mmol·L-1氯化镍、2 mmol·L-1钼酸钠、2 mmol·L-1硼酸。
1.2 试验方法
1.2.1重组菌的构建 将NCBI数据库中筛选出的4个Nrk基因和2个Ppk基因，分别命名为NRK-Kk、NRK-Ec、NRK-Gs、NRK-Hi、PPK-Bb、PPK-Cb，送由生工生物工程(上海)有限公司合成。通过Gibson酶将合成的目的基因与质粒连接构建6个重组质粒，通过CaCl2法转入表达宿主菌BW25113感受态细胞中，获得重组大肠杆菌pBAD-NRK-Kk/BW、pBAD-NRK-Ec/BW、pBAD-NRK-Hi/BW、pBAD-NRK-Gs/BW、pBAD-PPK-Bb/BW、pBAD-PPK-Cb/BW(简称NRK-Kk/BW、NRK-Ec/BW、NRK-Hi/BW、NRK-Gs/BW、PPK-Bb/BW、PPK-Cb/BW)。将重组菌株于37℃含链霉素(50 μg·L-1)抗性的LB培养基中培养1 h，再涂布于含链霉素的平板中培养12 h。经菌落PCR鉴定后筛选阳性转化子转至含链霉素的LB培养基中进行6～8 h的培养，将菌液送往尚亚生物技术有限公司进行测序，验证重组菌株是否发生移码突变。
1.2.2重组菌的培养与诱导 将-80℃的重组菌转接至含链霉素的平板划线活化，挑取单菌落接入含有链霉素的10 mL LB液体培养基中，37℃恒温摇床220 r·min-1过夜培养后按5%接种量接种至100 mL的ZYM自诱导培养基中，在30℃恒温摇床中220 r·min-1诱导18 h。取出菌液8 000 r·min-1离心10 min，弃上清收取菌体。
1.2.3NRK工程菌筛选 取1.2.2的诱导表达的菌液用Tris-HCl(pH 7.0、50 mmol·L-1)重悬菌体沉淀，冰浴超声破碎获得破碎菌液，即为粗酶液，进行SDS-PAGE分析及转化能力测定。催化反应体系(20 mL)为：50 mmol·L-1NR、50 mmol·L-1ATP、NRK(OD600nm=10)；
反应条件：37℃、pH 7.0、150 r·min-1恒温搅拌转化1 h。样品沸水浴1 min终止反应后8 000 r·min-1离心2 min取上清，稀释50倍后检测。使用HPLC法检测NMN生成量，采用C18柱(Agilent 5μm，4.6 mm×250 mm)，流速为1 mL·min-1，检测波长370 nm，柱温35℃。流动相为磷酸氢二钾和磷酸二氢钾各10 mmol·L-1。根据在单位时间内，NMN催化生成量进行菌株筛选。
1.2.4NRK工程菌转化体系优化 在NRK重组菌在pH7.0条件下，对温度梯度为31、33、35、37、39℃的转化体系测定转化率，分析确定工程菌催化反应的最适温度。在最适温度条件下，对pH梯度为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的转化体系测定转化率，分析确定工程菌催化反应的最适pH，检测方法及体系同方法1.2.3。
1.2.5PPK工程菌筛选 对PPK工程菌同出发NRK工程菌复配进行筛选，反应体系(20 mL)为：50 mmol·L-1NR、10 mmol·L-1ATP、10 mmol·L-1六偏磷酸钠、NRK(OD600nm=10)、PPK (OD600nm=10)，反应条件：37℃、pH 5.5、150 r·min-1恒温搅拌转化1 h。检测方法同方法1.2.2。
1.2.6双酶法转化条件优化 对工程菌复配体系进行析因设计，反应体系(20 mL)如下：50～100 mmol·L-1NR、5～20 mmol·L-1ATP、10 mmol·L-1六偏磷酸钠、NRK浓度(OD600nm:5～20)、PPK浓度(OD600nm:5～20)，反应条件：37℃、pH 5.5、150 r·min-1恒温搅拌转化1 h。检测方法同方法1.2.2。
1.2.7发酵罐培养及全细胞转化生产NMN 依据优化的结果，按照方法1.2.1构建了1株NRK-Gs & PPK-Cb/BW工程菌，将重组菌按照1.2.3方法活化后转接至100 mL液体培养基中，培养6～8 h后接种至装无机盐培养基的5 L发酵罐中培养，待菌体浓度OD600nm达到40～50时，添加终浓度为2 g·L-1阿拉伯糖，28℃诱导培养10～12 h，发酵液用8 000 r·min-1离心15 min，弃上清，收集菌体,进行全细胞转化。
2.1 NRK工程菌的表达与筛选
由图1可知，对4种重组菌经SDS-PAGE凝胶分析，NRK-Kk/BW、NRK-Hi/BW和NRK-Gs/BW表达的蛋白量在25～35 kDa，NRK-Ec/BW表达的蛋白量在40～50 kDa，表明4种Nrk基因均在大肠杆菌BW25113中成功表达。对4种NRK工程菌株进行验证筛选，在50 mmol·L-1NR和50 mmoL·L-1ATP的反应体系中以37℃、pH 7.0、150 r·min-1恒温搅拌反应1 h，检测NMN生成量进行比对筛选。由图2可知，NRK-Gs/BW催化产生的NMN含量及转化率是4个工程菌株当中最高的，1 h催化生成NMN 28.12 mmol·L-1,转化率最高达到56.24%，与其他菌株最高相差38%以上。因此初步选择NRK-Gs/BW作为出发工程菌。
图1 SDS-PAGE分析重组大肠杆菌NRK的表达Fig.1 NRK expression of the recombinant Escherichia coli by SDS-PAGE analysis
2.2 NRK工程菌株反应条件优化
为提高出发菌株的转化率，对反应温度和pH进行了优化。结果(图3)表明，4种工程菌的最适反应温度均在35～39℃；
NRK-Kk/BW、NRK-Hi/BW、NRK-Ec/BW最适pH为7.0，NRK-Gs/BW最适pH为4.5～5.5，为嗜酸性酶。在NRK-Gs/BW体系中，NR转化率最高时为86%。
图2 NRK工程菌转化能力测定Fig.2 Determination of the transformation ability of NRK engineering bacteria
图3 温度及pH对不同NRK催化转化率的影响Fig.3 Effect of temperature and pH on the catalytic conversion of different NRK
2.3 PPK工程菌株表达与筛选
由图4可知，对2株重组菌经SDS-PAGE凝胶分析，PPK-Bb/BW和PPK-Cb/BW条带都在25～35 kDa，与预测值相符合。由图5可知，NRK-Gs/BW与PPK-Bb/BW(图5 A1)搭配的催化反应最高转化率为76.6%，副产物(ADP+AMP)的量为6.6 mmol·L-1，NRK-Gs/BW与PPK-Cb/BW(图5 B1)搭配时，最高转化率达到89.8%，副产物的量为5.22 mmol·L-1。因此，PPK-Cb/BW与PPK-Bb/BW相比，转化率更高且副产物更少，选用PPK-Cb/BW同NRK-Gs/BW进行双酶催化反应。
2.4 催化体系析因结果分析
利用JMP软件对4个影响双酶催化结果的因素进行析因设计，对双酶催化反应的转化率等数据进行拟合处理，见图6。根据JMP结果推断，反应体系为：50 mmol·L-1NR、10 mmol·L-1ATP、35 mmol·L-1Mg2+、NRK(OD600nm=15)、PPK(OD600nm=15)时转化率最高。
图4 SDS-PAGE分析重组大肠杆菌PPK的表达Fig.4 PPK expression of the recombinant Escherichia coli by SDS-PAGE analysis
图5 PPK工程菌株的筛选Fig.5 Screening of the PPK engineering strain
2.5 双酶工程菌验证
由图7可知，在50 mmol·L-1NR、10 mmol·L-1ATP、35 mmol·L-1Mg2+、NRK-Gs & PPK-Cb/BW(OD600nm=15)反应体系中，pH=5.5，反应温度为37℃，转化3 h，NR转化率最高可达99.96%，NMN产量为49.98 mmol·L-1。同时，反应产物中AMP仅0.42 mmol·L-1，有利于后期NMN产物纯化。
图6 双酶催化反应体系响应面设计Fig.6 Response surface design of the dual-enzyme catalytic system
图7 双酶工程菌优化体系验证Fig.7 Verification of the optimization system of dual-enzyme engineering bacteria
本试验通过基因工程成功构建重组NRK-Kk/BW、NRK-Ec/BW、NRK-Gs/BW、NRK-Hi/BW 4株菌株，通过条件优化筛选出1株嗜酸性的高效转化NR生成NMN的菌株NRK-Gs/BW。在体系中引入多聚磷酸激酶重组菌PPK-Cb/BW后，ATP使用量降低为初始的20%。通过软件对析因设计试验结果分析得出，双酶法最优的反应体系为：50 mmol·L-1NR、10 mmol·L-1ATP、35 mmol·L-1Mg2+。最后，构建了双酶工程菌NRK-Gs&PPK-Cb/BW进行高密度发酵和转化验证，结果显示NR转化率最高达到99.96%。本试验构建的双酶工程菌催化NR合成NMN,和单酶法相比ATP的使用降低80%，相较于现有的双酶法转化率最高可达到99.96%，能有效提高底物利用率。同时筛选的NRK和PPK均为嗜酸性酶，能有效地减少NMN的降解以及提高稳定性，有利于后期纯化工作。但仍存在一些问题需要解决，如在保证转化率的同时提高底物浓度和产量，这将有助于NMN工业化生产的放大。
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