马素娟，王 宇，刘汉嶂，韩晓义，陈 帅，刘志华，陆秀君
（沈阳农业大学 林学院，辽宁 沈阳 110000）
植物根际促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是一类存在于植物根际土壤中对植物生长发育有益的细菌，在土壤中自由生活或者依附于植物根际，能够改良土壤环境、协助植物吸收营养和诱导植物抗性，进而提高作物产量和品质[1-2]。芽孢杆菌Bacillusspp.是当前研究最为广泛的根际促生细菌，因其具有适应性强、抗逆性强和作用效果快速、明显等优点[3]，成为农业应用中极具前景的候选菌。芽孢杆菌能与植物的根毛快速结合，定植后形成稳定的内生菌，通过固氮、溶磷、解钾等途径来提高土壤矿质元素的可利用性[4]，同时还能合成植物生长调节物质以及分泌次生代谢产物来刺激植物种子萌发和生长[5]。许多研究表明，芽孢杆菌对植物的生长发育、作物产量以及减轻植物的胁迫效应等均具有积极作用[6-8]。王雪菲[9]研究发现蜡状芽孢杆菌Bacilluscereus对小白菜的促生作用是由于其分解产生的速效磷、IAA 和GA 共同作用的结果；
接种外生菌根真菌能增强槲树Quercusdentata幼苗对营养元素的吸收，提升其光合能力[10]。部分菌株混合接种对植物生长具有协同增效的现象，不同菌株间以浮游或生物膜模式相互作用[11-13]。混合菌剂处理下的玉米产量最高，而且土施方式优于叶面喷施[14]。张紫瑶等[15]对番茄的研究表明绿色木霉Trichodermaaviride和枯草芽孢杆菌混合接种可以显著改善幼苗根系形态，并提高土壤速效养分含量。此外，芽孢杆菌可通过提高植株的免疫力和抗病性来间接促进植物生长[16]。
研究表明，接种外生菌根真菌显著促进了辽东栎Quecusliaotungensis幼苗的生长，接种植株的株高、生物量、净光合速率和氮磷含量均高于未接种植株[17]。接种黑孢块菌TuberMelanosporum有利于冬青栎Quercusilex幼苗叶片内的水分运输，从而增加CO2的固定和叶比质量；
也有利于幼苗在干旱期间的生长和养分吸收[18-19]。芽孢杆菌目前在农作物和蔬菜促生增产、果实品质改善和抗病等方面的应用广为采纳。然而，芽孢杆菌对蒙古栎Quercusmongolica生长的影响未见相关研究。
蒙古栎属于壳斗科Fagaceae 栎属Quercus，是我国东北地区主要的用材树种和建群树种。蒙古栎苗期生长缓慢，根系发育不良，造林不易成活[20]。因此，提高苗木质量是保证蒙古栎人工造林成活率和保存率的前提。本研究采用不同组合、不同浓度的芽孢杆菌对一年生蒙古栎播种苗进行灌根处理，初步探究芽孢杆菌对蒙古栎幼苗生长的促生效果，以期为培育高质量蒙古栎苗木提供数据参考。
1.1 试验材料
蒙古栎种子于2020 年秋采自辽宁省抚顺市清原县优良蒙古栎天然次生林的同一株母树，经高锰酸钾消毒处理后混沙越冬，低温（0～4 ℃）下保存。于2021 年春季选用饱满的蒙古栎种子播种育苗。
供试菌株：枯草芽孢杆菌Bacillussubtili、地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis和解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens菌剂由沈阳农业大学林木病理基础研究实验室提供，具体方法为：将3 种芽孢杆菌分别接种在LB 液体培养基中（含牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，蔗糖10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 值为7.0），在25～28 ℃条件下150 r·min-1振荡培养72 h 后得到的芽孢杆菌发酵液浓度为3×109CFU·mL-1。
1.2 试验设计与方法
试验地位于沈阳农业大学试验基地（属于北温带半湿润大陆性季风气候，年平均气温6.8～8.0 ℃，年平均降水量750～850 mm，全年日照时间为2 372.5 h）。2021 年5 月7 日将饱满一致的蒙古栎种子播种于直径12 cm ×高 29 cm 的黑色塑料营养钵中（当地大田表土）进行育苗。出苗后约40 d，选择长势一致的幼苗进行菌剂灌根处理。
试验采用完全随机设计。采用3 种菌剂处理：B1（枯草芽孢杆菌单一菌剂）、B2（枯草芽孢杆菌+地衣芽孢杆菌1∶1 混合）、B3（枯草芽孢杆菌+地衣芽孢杆菌+解淀粉芽孢杆菌1∶1∶1 混合）。每种菌剂设置2 个浓度梯度，即C0（菌悬液原液）、C2（将原液稀释20 倍），并以清水做对照（CK）。每处理蒙古栎幼苗9 株，3 次重复，共189 株。于7 月和8 月初分别进行一次灌根处理，每盆每次浇灌200 mL 菌剂，对照组浇灌相同体积的自来水。
1.3 指标测定
在9 月初测定蒙古栎幼苗的苗高、地径和叶片数。选择上部完全展开的幼叶，用Li-6400P 便携式光合测定系统分析仪测定苗木的净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）和胞间CO2浓度（Ci），在9:00—11:00 进行，3 次重复。采用酒精浸提法测定叶绿素含量[21]。用扫描仪分析测定总根长、总根表面积、根平均直径、总根体积、分叉数和根尖数[22]。将不同器官（根、茎、叶）于105 ℃下杀青30 min，80 ℃下烘干72 h 后称质量。采用蒽酮比色法测定各器官可溶性糖和淀粉含量[21]，均为3 次重复。
1.4 数据处理
采用Excel 2019 和SPSS 19.0 软件对数据进行处理，运用双因素方差分析（Two-way ANOVA）和多重比较Duncan 法进行分析（P＜0.05），采用Origin 2018 软件作图。
2.1 芽孢杆菌对蒙古栎幼苗生长的影响
不同菌剂对蒙古栎幼苗苗高均起到促进作用，菌剂种类主要影响苗高和叶片生长，且菌剂种类和浓度对苗高存在交互作用（表1）。苗高和叶片数均以B2C0 处理效果最佳，增长量分别是对照的6.72 倍和7.00 倍（表2 和图1A—B）。而浓度对幼苗生长的影响大于菌剂种类（表1），原液效果优于稀释液。菌剂原液处理显著增加了幼苗的叶片数，仅B1C0 处理显著促进了地径生长，其生长量是对照的1.74 倍，其余处理未达到显著水平。相比对照，B1 和B2 菌剂稀释液仍有较好的促生效果，而B3 菌剂稀释后与其他2 种菌剂相比效果明显下降，接近对照水平（表2）。
图1 芽孢杆菌处理后蒙古栎幼苗生长情况Fig.1 Growth of the Q. mongolica seedlings treated with Bacillus
表1 菌剂种类和浓度对蒙古栎幼苗生长的双因素分析Table 1 Two-way ANOVA analysis of bacterial agent types and concentrations on the growth of Q. mongolica seedlings
表2 不同处理对蒙古栎幼苗地上生长的影响†Table 2 Effects of different treatments on the aboveground growth of Q. mongolica seedlings
菌剂种类和浓度对蒙古栎幼苗总根体积、根尖数和分叉数均有显著影响，但无交互作用（表1）。菌剂原液显著增加了幼苗根系的分叉数，而稀释液和对照差异不显著（表3 和图1C）。菌剂浓度和种类对总根表面积和平均直径无显著促进效果，但是存在交互作用（表1），分别以B2C2和B3C0 处理效果最显著。菌剂种类对根系生长的影响大于浓度，以B2 菌剂更好，其中稀释液处理的幼苗总根长、总根表面积、总根体积和根平均直径均显著高于对照，而原液显著增加了根尖数和分叉数。除总根长和根尖数外，B3 菌剂原液处理的其余各项根系指标均显著提高。各处理与对照相比，总根表面积、根尖数和分叉数最高分别增加了134.59%、49.53%和73.68%（表3）。
表3 不同处理对蒙古栎幼苗根系形态的影响Table 3 Effects of different treatments on the root morphology of Q. mongolica seedlings
2.2 芽孢杆菌对蒙古栎幼苗生物量的影响
菌剂种类和浓度对幼苗各器官生物量积累均有显著影响，且存在交互作用（表4）。3 种菌剂原液均显著提高了蒙古栎幼苗生物量的积累。稀释液中，仅B3C2 处理显著提高了幼苗总生物量（图2A）。不同菌剂处理对幼苗各器官生物量分配比例的影响不同：B1 菌剂处理的幼苗茎和叶生物量比例提高，而根系比例下降；
B2 菌剂原液明显降低了幼苗根和叶的生物量比例，但显著提高了茎的分配比例；
B3 菌剂提高了根系分配比例，降低了叶片分配比例，而茎中无明显变化（图2B）。
图2 不同处理对蒙古栎幼苗各器官生物量及分配模式的影响Fig.2 Effects of different treatments on the biomass and distribution patterns of each organ of Q. mongolica seedlings
表4 菌剂种类和浓度对蒙古栎幼苗各器官生物量的双因素分析Table 4 Two-way ANOVA analysis of bacterial agent types and concentrations on the biomass of various organs of Q. mongolica seedlings
2.3 芽孢杆菌对蒙古栎幼苗光合作用和叶绿素含量的影响
不同菌剂种类对幼苗光合作用均有显著影响，而浓度对Gs无显著影响，除Tr外，菌剂种类与浓度均存在交互作用（表5）。B1 和B3 菌剂均显著提高了幼苗的Pn、Gs和Tr，其中以B3C0 处理效果最显著，各指标分别高于对照的72.13%、54.17%和19.71%，而B2 菌剂效果不显著。菌剂原液处理效果优于稀释液，B1 和B3 菌剂稀释液对幼苗Pn、Gs和Tr仍有显著的促进作用，但Ci大于原液。然而，除B3C2 外，其余各处理的Ci均小于对照（表6）。
表5 菌剂种类和浓度对蒙古栎幼苗光合作用的双因素分析Table 5 Two-way ANOVA analysis of bacterial agent types and concentrations on the photosynthesis of Q. mongolica seedlings
表6 不同处理对蒙古栎幼苗光合作用的影响Table 6 Effects of different treatments on the photosynthesis of Q. mongolica seedlings
菌剂种类与浓度对幼苗叶绿素含量均有显著影响，且存在交互作用（表5）。菌剂原液处理的幼苗叶绿素a 和叶绿素b 含量均显著高于对照。相比之下，B3 和B1 菌剂分别有利于幼苗叶绿素a和叶绿素 b 含量的积累。与对照相比，B3 菌剂稀释液显著提高了叶绿素 b 和叶绿素总含量，其余2种稀释液效果未达到显著水平（图3）。
图3 不同处理对蒙古栎幼苗叶绿素含量的影响Fig.3 Effects of different treatments on chlorophyll content of Q. mongolica seedlings
2.4 芽孢杆菌对蒙古栎幼苗非结构性碳水化合物（NSC）含量的影响
芽孢杆菌处理后，蒙古栎幼苗可溶性糖、淀粉和NSC 含量呈下降趋势，但NSC 在幼苗各器官的分配模式响应不同的菌剂处理（图4）。B1 和B3 菌剂处理可显著提高幼苗根系中可溶性糖含量（图4A），B2 菌剂显著提高根系中淀粉和NSC含量（图4B、D）。各处理的茎和叶中可溶性糖含量以及叶中淀粉含量显著降低，而茎中淀粉含量没有变化（图4A—B）。同时，B1 和B3 菌剂处理后，幼苗根系中的糖可溶性/淀粉升高，而茎中比值下降，各处理叶中的可溶性糖/淀粉均显著高于对照。相比对照，B3 菌剂处理的幼苗总糖/淀粉显著升高，而B2 菌剂显著下降（图4C）。
图4 不同菌剂对蒙古栎幼苗非结构性碳水化合物（NSC）含量的影响Fig.4 Effects of different inoculants on the content of non-structural carbohydrates (NSC) in Q. mongolica seedlings
3.1 讨 论
3.1.1 芽孢杆菌对蒙古栎幼苗生长的影响
施用枯草芽孢杆菌可以有效促进作物生长并提高其产量[23]。Rieske[24]发现真菌定殖的美国红栎Quercusrubra幼苗比未定殖的表现出更高的生产力，包括叶片数量、叶面积和地径；
陈晓琳等[25]对花榈木Ormosiahenryi的研究表明，解磷能力较强的菌株对其生长的促进作用也更为明显。本研究与上述研究结果一致，接种芽孢杆菌可促进蒙古栎幼苗地上部分生长，其中苗高、地径和叶片数均显著增加。可能是因为芽孢杆菌通过溶解土壤中难溶的无机物，为植物提供更多有效养分，同时产生植物生长激素，促进植物生长[26]。微生物菌剂还可以通过改善根系构型促进植物对水分和养分的吸收。马飞等[27]研究了不同剂量的甲基营养型芽孢杆菌菌剂对黄瓜穴盘苗的影响，结果表明该菌剂可以不同程度地促进黄瓜根系生长，并且增加了植株 N、P、K 元素的积累量。本研究中，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌2 种菌剂混合以及枯草、地衣和解淀粉芽孢杆菌3种菌剂混合处理后，显著增加了蒙古栎幼苗总根长、根表面积、根体积、根系粗度和根尖数，与芽孢杆菌在百合Lilium leucanthu和人参Panaxginseng中的[28-29]研究结果相似。因此，认为芽孢杆菌与植物的互作增加了植物根系吸收面积及其对土壤深层养分的利用，提高了蒙古栎幼苗的生长潜力。
已有研究表明，芽孢杆菌可以提高甘蔗根和茎的鲜质量和干质量[30]。Ribeiro 等[31]对珍珠粟Pennisetumglaucum的研究也得到类似结果，由于菌株能够在体外产生IAA，从而增加了植物的干物质量。本研究中，虽然幼苗的各器官对3 种菌剂的响应不同，但菌剂处理显著增加了蒙古栎幼苗整株生物量，且各菌剂原液处理均显著增加了幼苗根系生物量。其中，3 种菌剂混合处理可促进生物量在根系中分配；
枯草和地衣芽孢杆菌菌剂混合处理有利于生物量更多地分配到茎中；
而枯草芽孢杆菌单一菌剂处理明显减少了根系生物量的积累，促使其分配到茎和叶中。He 等[32]研究发现芽孢杆菌和恶臭假单胞菌Pseudomonasputida共接种显著提高了番茄的根茎比，而3 种或4 种细菌的共接种对植物地上生物量更有利，且会降低根茎比，但复合菌剂效果均优于单一菌剂。罗佳煜等[33]对樟子松Pinussylvestnisvar.mongolica的研究也表明，根际细菌和菌根真菌互作可以提高植物的生物量，改善植物和根际土壤的养分含量。这说明适合的菌株互作能起到加成效应，然而部分研究发现2 种细菌共接种对玉米生长没有协同增效现象[34]。本研究发现，3 种细菌共接种更有利于蒙古栎幼苗根系生物量积累，且增大了根冠比。并且枯草和地衣芽孢杆菌2 种细菌共接种具有协同效果，其在幼苗地上部分和根系形态生长方面的效果整体优于枯草芽孢杆菌单一菌剂。这可能和菌株自身功能、共接种后的互作、寄主植物、土壤和温度等有关。
3.1.2 芽孢杆菌对蒙古栎幼苗光合作用和NSC 含量的影响
光合作用是植物生长的物质和能量来源，对林木的生长和产量产生直接的影响[35]。菌根化可以上调寄主植物的净光合速率，以满足共生过程中增加的碳水化合物需求[36]。本研究发现，菌剂处理显著促进了蒙古栎幼苗的光合作用，与山新杨Populusdavidiana×P.albavar.pyramidalis和青冈栎Cyclobalanopsisglauca的研究结果一致[37-38]。这说明施用芽孢杆菌能够通过提高叶绿素含量和光合生理指标来促进蒙古栎幼苗生长，增强其对营养物质的积累能力。原因可能是菌根系统提取土壤水分或根外菌丝扩大了吸收区域，增加水分吸收和运输，从而提高了Gs和Tr，增加了CO2的固定。同时，叶绿素含量的升高增强了光能的吸收和转化，进而提高了植物的光合速率[39]。保善存等[40]得到了相似的研究结果，解淀粉芽孢杆菌菌剂有助于枸杞Lyciumbarbarum叶片 SPAD 值增加，并提高其光合能力。然而，菌剂处理的Ci小于对照，可能是接菌影响其非气孔因素，如叶肉细胞光合活性增大等[41]。
经光合作用合成的有机物质除一部分用于构建植物体和呼吸消耗外，其余部分将以NSC 的形式储存于植物体内，而NSC 的动态变化主要是由于光合作用生产的有机碳与用于生长和呼吸消耗的碳不平衡造成的[42-43]。Wang 等[44]发现，干旱胁迫下接种外生菌根真菌增强了油松Pinus tabulaeformis的光合作用，还显著提高了幼苗各组织的NSC 浓度和可溶性糖含量。本研究中，接种芽孢杆菌对幼苗NSC 的组成有不同影响，这可能是由于NSC 储备可以调整其组织含量以响应碳平衡的变化。菌剂处理明显降低了蒙古栎幼苗茎和叶中的可溶性糖和淀粉含量，显著增加了根系中的NSC 含量。可能是接种菌剂为幼苗提供了充足的营养，增强了幼苗的光合能力，进而合成更多的光合产物。但是在无逆境胁迫时，可溶性糖充分用于幼苗生长，同时通过减少淀粉的积累来满足植物的快速生长，因而积累了更多的生物量。接种菌剂处理后，叶片中的NSC 可能向下运输给芽孢杆菌维持菌丝正常生长，导致NSC 更多地向根中转移[45-46]；
也可能是菌剂诱导苗木以根系为生长中心，光合产物可以优先运输到根系部分，以满足根系的快速生长。试验结果表明，NSC 在根系中积累有利于植株幼苗阶段的生长[47]。相比之下，对照组幼苗根系生长缓慢，可溶性糖在叶片合成后仅有少部分向下运输和消耗，且一部分以淀粉的形式储存。可能是幼苗生长需求小，负反馈机制造成NSC 在叶中积累，也相应减少了幼苗各器官的生物量。此外，各处理叶片中的可溶性糖/淀粉均高于对照。说明接种菌剂处理的幼苗因光合作用增强，叶片中合成更多的可溶性糖，而各器官的快速生长会加大对糖的消耗，相应减少淀粉的积累。叶片作为源器官，合成的光合产物主要用于生长消耗，同时以可溶性糖的形式运输到库器官中，并且源器官中含量升高便于向其他器官运输[47]。
本研究仅对3 种芽孢杆菌的3 种组合进行了试验，未对其所有组合进行全面探讨，而且各混合菌剂只采用了等比例混合方式，存在一定的局限性。因此，还可以继续研究各菌株促进蒙古栎生长的最佳配比。此外，后续可对根际细菌群落对菌剂灌根后的响应、植株和土壤中的养分变化情况以及菌株与蒙古栎共生关系中营养物质分配和定殖模式等方面做进一步研究，明确其促生机制，为实际生产中培育优质蒙古栎苗木提供理论依据。
3.2 结 论
芽孢杆菌可以改变蒙古栎幼苗地上部分和根系形态，增加根系吸收面积，提高叶片的光合作用能力，改变NSC 在各器官中的分配模式，从而促进幼苗生长。各菌剂原液效果较好，且以枯草+地衣+解淀粉芽孢杆菌混合菌剂处理效果最显著，枯草+地衣芽孢杆菌混合菌剂与枯草芽孢杆菌单一菌剂综合效果相当。
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