杨雨清 姚琼璐 徐涛涛*
创伤后骨关节炎（post-traumatic osteoarthritis，PTOA）是由前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）断裂等急性机械损伤引起的以关节软骨退变为主要病理变化的一种疾病，通常表现为关节疼痛以及活动功能障碍，可产生重大的社会和经济影响。最初的机械组织损伤以及随后的炎症反应是驱动PTOA 发生发展的重要因素，其机制目前尚未明确。研究发现机械损伤可对软骨细胞产生重要影响，其中对其线粒体功能的改变可引起软骨细胞能量代谢障碍、活性氧堆积，促使软骨细胞释放炎症介质，造成软骨退化，最终导致PTOA的发生。基于软骨细胞线粒体可能在创伤后炎症中发挥重要作用，软骨细胞线粒体逐渐成为PTOA 防治研究的主要靶标之一。本文综述软骨细胞线粒体在PTOA 中的研究进展。
线粒体以产生ATP 的形式为软骨细胞的活动及软骨细胞周期控制提供能量，同时，线粒体也是整合多种先天免疫信号通路的分子平台。软骨由软骨细胞以及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）组成，ECM 在软骨细胞周围大量存在，可产生ECM 蛋白酶，ECM 蛋白酶的活化是加速PTOA的关键因素，通常降解和分解软骨是纤维ECM 蛋白［1］。线粒体调控ECM 中相关的蛋白酶产生及分解，有助于维持ECM的稳态。在软骨细胞中，线粒体是软骨细胞中重要的代谢中心，软骨细胞通过加强线粒体呼吸提高三羧酸循环效率，促进细胞外基质的生物合成［2］。
线粒体不仅有助于维持ECM 的稳态，还调控软骨细胞的生成、增殖、分化和衰老。线粒体自噬促进骨髓间充质干细胞的成软骨分化［3］，而成软骨细胞可进一步生成软骨细胞。线粒体通过分配钙、ATP 和活性氧以满足软骨细胞的需求，并帮助软骨细胞克服代谢和微环境造成的压力，实现软骨细胞的增殖。当线粒体膜电位显著下降时，软骨细胞分化标志基因表达水平下调［4］，表明线粒体膜电位与软骨细胞分化存在密切联系。线粒体细胞膜电位损失会发生能量产生减少、膜通透性增加，最终导致各种凋亡诱导因子从线粒体释放进入软骨细胞基质［5］，引起软骨细胞的衰老和凋亡。
软骨细胞受到机械损伤后发生的一系列病理变化可分为3 期，分别为急性损伤期、炎症期、慢性退化期。软骨细胞首先进入PTOA 急性损伤期。急性损伤后会造成线粒体功能障碍，随后ROS 产生增多［6］，激活NLRP3 炎症小体引发炎症反应［7］，此阶段可视为PTOA 的炎症期。继而软骨因急性损伤和线粒体功能障碍而发生退变，这可视为PTOA 的慢性退化期。软骨细胞线粒体在急性损伤期、炎症期及慢性退化期均起到重要作用。
3.1 软骨细胞线粒体与急性机械损伤 机械力的影响下，线粒体的生物学特征发生一定的变化。单向循环拉伸研究表明机械力使线粒体发生肿胀。单向循环拉伸后机械力使细胞发生损伤，Ca2+通道被激活，细胞发生急速的钙缓冲，细胞内Ca2+急剧上升，由于细胞膜通透性增大，细胞质基质内流入Ca2+，并迅速将Ca2+隔离在线粒体内，线粒体即发生肿胀［8］，后续线粒体呼吸功能受损，出现线粒体基质破坏、线粒体膜去极化等现象。最近一项研究报道表明机械力可激活一种高水平的钙通道Piezo1［9］。机械压力刺激下，软骨细胞膜胆固醇结构被破坏，这直接导致Piezo1 通道的机械激活［10］。激活的Piezo1 可以促进钙内流，线粒体肿胀，随后发生功能障碍。另一个钙内流通道TRPV4 被证明参与机械刺激及随后的氧化应激反应［11］。机械力使TRPV4 离子通道激活后，线粒体基质降解酶（包括MMP 和ADAMTS）和去整合素金属蛋白酶（ADAM）在软骨中表达，并通过调节ACAN 基因的表达，诱导关节软骨细胞Ca2+流入［12］，线粒体发生肿胀，功能受损，参与PTOA 中软骨的破坏［13］。软骨细胞受到机械刺激后，软骨细胞中的Piezo1 通道和TRPV4 通道即产生上述变化，其介导压力诱导的软骨细胞膜张力增高，并导致胞浆内Ca2+浓度增高，这与随后的损伤反应密切相关［10］。Piezo1 通道在软骨细胞中的表达增加导致一个前馈机制，即在基础状态下和机械变形后诱导过量的细胞内Ca2+内流［14］。
受到机械刺激或损伤后2 h，内源性线粒体呼吸功能受损，出现线粒体基质破坏、线粒体膜去极化等现象。在损伤后早期靶向线粒体电位、容量和膜极化可能会导致软骨的破坏。软骨所受机械力冲击的程度在决定疾病严重程度上也很重要，实验表明，15～20 MPa的机械应力范围内冲击软骨组织，即可导致软骨细胞死亡［15］。而低于此范围的冲击力可导致线粒体基质破坏、线粒体基质降解酶（包括MMP 和ADAMTS）的上调、线粒体膜去极化［15］以及细胞反应［16］，但不导致软骨细胞的死亡。当机械力超过阈值时，即可发生机械损伤。过度的机械力也可造成该区域一定比例的细胞死亡，继而产生损伤相关分子模式（DAMPs）。DAMPs 在组织受损时可激活先天免疫系统，线粒体参与机体的天然免疫反应的调节，机械损伤后，线粒体相应发生损伤，可释放mtDNA，线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM），ROS，ATP，心磷脂和甲酰肽等作为DAMPs 诱导后续的炎症反应［17］。
3.2 软骨细胞线粒体与信号通路 （1）TLR 信号通路：急性损伤期机械组织损伤可导致一定比例的细胞死亡，继而产生损伤相关分子模式（danger-associated molecular patterns，DAMPs），然后由TLR 蛋白在细胞表面检测到［18］。TLR 蛋白由细胞外结构、单路径跨膜结构和细胞内结构组成，被归类为模式识别受体（PRR），因其识别微生物中的保守分子结构，称为病原体相关分子模式（PAMPs）［19］。TLR 通过骨髓分化因子88（MyD88）和MyD88 依赖性通路发出信号［20］。MyD88 由两个结构域组成：TIR 结构域以及死亡结构域，TIR结构域与toll 样受体的TIR 结构域相互作用。TLR4 的激活将TRAM 和干扰素反应因子（TRIF）招募至TLR4 的TIR 域。RIP1（受体相互作用蛋白1）介导由TRIF 的羧基末端区域诱导NF-κB。TBK1 磷酸化IRF3，IRF3 与p300 和CBP（CREB结合蛋白）复合，激活干扰素诱导基因IP-10 和RANTES 的表达。TRIF 可以结合TRAF6 并通过激活NF-κB 产生炎症细胞因子［19］。而后可驱动炎症级联反应，使促炎、促分解代谢因子增加，使PTOA 进入炎症期。（2）NF-κB 信号通路：过度的机械力也可刺激软骨细胞通过激活NF-κB 和MAP 激酶等多种途径，开始分泌对ECM 有降解作用的酶，如金属蛋白酶（metalloprotease，MMP）和蛋白聚糖酶。这一过程受线粒体的调控，与其产生的ROS 增加密切相关［21］。过度的关节软骨机械应力可触发线粒体释放ROS，ROS 可介导NF-κB信号通路的激活，同时激活MAP 激酶级联途径［22］，MMP 和蛋白聚糖酶等开始被分泌，导致ECM 的降解。细胞外胶原蛋白被这些降解性蛋白酶逐步破坏，蛋白聚糖丢失，促使ECM发生降解，而ECM 中充满着胶原蛋白和聚集蛋白聚糖等维持软骨细胞健康稳态的必需物，ECM 降解后可软骨细胞健康稳态被破坏，导致软骨细胞分解代谢活动明显增强，细胞进入急性损伤期。
3.3 软骨细胞线粒体与炎症介质 研究发现，促炎细胞因子的水平在人关节损伤后数天内达到峰值。在一项针对34 例急性前交叉韧带损伤患者的横断面研究中，在损伤后24 h 内检测到滑液中最高水平的炎性细胞因子。这表明炎症期在PTOA前期中占重要地位。机械损伤后可产生DAMPs，线粒体发生功能障碍，能量代谢异常，随后ROS 产生增多，从而激活NLRP3 炎症小体［7］。在损伤后即刻，NLRP3 等一些重要的炎症前体在关节滑膜液中大量存在［23］，表明急性机械损伤后，线粒体立刻发生功能障碍，引发后续炎症。
3.3.1 DAMPs DAMPs 是PTOA 炎症期一个重要的相关信号。DAMPs 诱发关节炎症的一个中心机制是激活NLRP3 炎症小体和随后产生白细胞介素1β（IL-1β）［16］。机械关节损伤造成一定比例的细胞死亡时，会导致DAMPs 的产生，DAMPs 可造成软骨细胞线粒体功能障碍，其主要表现为呼吸链复合物活性下降和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成减少［24］，线粒体膜电位（membrane potential，MMP）下降，活性氧（reactive oxygen species，ROS）和氧化应激（oxidative stress，OS）增加［25］，线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）受损，钙调节障碍等［26］。这些变化可诱导软骨细胞激活NLRP3 炎症小体，释放炎症介质［26］。有研究发现，炎症介质如白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等在PTOA 关节中高度上调，诱导过量ROS 产生和基质降解蛋白酶的表达，导致软骨ECM 降解，从而导致关节功能障碍。
3.3.2 NLRP3炎症小体 NLRP3炎症小体是炎症期一个重要的相关信号。NLRP3 炎症小体由受体蛋白NLRP3，适应分子ASC 以及Caspase-1 组成［16］。IL-1β 前体从无生物活性活化为有生物活性需要Caspase-1 的裂解。NLRP3 通过进入NLRP3 炎症小体的Caspase-1 和ASC 而得到激活信号，继而与ASC 和Caspase-1 发生寡聚化，这就激活Caspase-1，随后IL-1β 被激活而进入活性形式［16］。然而，这整个过程已被证明处于线粒体控制之下。炎症小体激活的调节与高线粒体膜电位、线粒体ROS 和线粒体DNA 均有关。
3.3.3 线粒体膜电位 有研究发现，线粒体膜内电位不可逆降低时导致NLRP3 触发的Caspase-1 激活，因此可以认为线粒体膜电位与NLRP3 炎症小体的激活有关。NLRP3 被激活后Caspase-1 通过Ca2+信号途径被钙蛋白酶释放［27］。钙蛋白酶活性增强依赖于接近40 mV 的未破坏的真核细胞膜电位。由于真核细胞的去极化或超极化抑制钙蛋白酶活性的增强，从而抑制NLRP3 的激活［27］。这表明，去极化或超极化带来的线粒体膜电位对于NLRP3 的激活具有抑制作用，高线粒体膜电位参与调节炎症小体的激活。
3.3.4 线粒体ROS 另一方面，线粒体ROS 积累时可激活NLRP3 炎症小体［7］。研究表明线粒体ROS 产生可能导致NLRP3 活化，以及IL-1β 分泌，继而使线粒体膜通透性提高和细胞死亡。NAKAHIRA 等发现使用线粒体复合物I 抑制剂鱼藤酮治疗能增强LPS 和ATP 刺激巨噬细胞中的caspase-1活化和IL-1β 分泌［28］。因此，线粒体中ROS 是导致NLRP3活化以及后续炎症反应产生的一个重要因素。
3.3.5 线粒体DNA 研究显示受损的线粒体DNA 可参与激活NLRP3 炎症小体，进一步支持线粒体在炎症小体激活中的作用［29］。线粒体DNA 由双链环状分子组成，附着在基质侧的线粒体内膜上，靠近细胞ROS 的主要来源，因此，线粒体DNA 特别易发生氧化损伤［29］。NLRP3 炎症小体激活剂如细胞外ATP 可触发钾离子外流、线粒体膜电位丧失和线粒体ROS产生［29］。这些可导致线粒体DNA 氧化并释放到细胞质中，而氧化的线粒体DNA 可直接作为NLRP3 激动剂［30］。氧化的线粒体DNA 与NLRP3 结合可促进炎症小体的寡聚［30］。通过抑制线粒体自噬能使细胞中功能障碍性线粒体不断积累，且最终增加细胞质基质中的线粒体DNA 总和［28］，然后导致NLRP3炎症小体的激活。
3.3.6 白细胞介素1β（IL-1β） 白细胞介素1β（IL-1β）是创伤性损伤后急性关节炎症的重要介质，同样也是PTOA的一个重要相关信号。IL-1β的释放需要一系列步骤。前体蛋白的合成和积累是必需的，包括pro-IL-1β 和NLRP3，这个过程由几个刺激步骤完成，其中包括病原体相关分子模式分子（PAMPs）等微生物产物的刺激。病原体识别受体（PRRs）（如Toll 样受体（TLRs））在 PAMPs 刺激下被激活［31］。PRR被激活后，Caspase-1 和ASC 进入NLRP3 炎症小体，NLRP3得到激活信号，继而与ASC 和Caspase-1 发生寡聚化，这就激活了Caspase-1，随后IL-1β 被激活的Caspase-1 裂解进入活性形式［16］。
3.4 软骨细胞线粒体与PTOA 慢性退化 炎症期后，关节进入慢性退化期。PTOA慢性退化期的病理特征以软骨和软骨下骨的吸收引起的软骨退化以及病理性炎症和血管增生为主，其与骨关节炎（osteoarthritis，OA）病理表现相似，但急性组织损伤导致的PTOA 骨吸收和血管增生更为活跃［32］。大量证据支持线粒体功能障碍在PTOA 慢性期中的作用［24］，其与PTOA 慢性期中的骨吸收作用和血管增生作用存在密切联系。
PTOA 急性组织损伤期和炎症期造成线粒体功能障碍，继而生物能量衰竭、氧化应激累积。ROS 增加是氧化应激的直接产物，可引发线粒体DNA 损伤，引起终末期线粒体功能障碍。在从终末期OA 患者中分离出的软骨细胞中可以发现，线粒体功能障碍与后期病理变化相关，包括金属蛋白酶-1（MMP-1），金属蛋白酶-3（MMP-3）和金属蛋白酶-13（MMP-13）表达上调，胶原蛋白和蛋白聚糖合成减少以及软骨病理性钙化［33］，间接表明线粒体功能障碍可引起软骨吸收作用，而PTOA 下的软骨吸收作用更为强烈，这或许可以反推出急性损伤条件下更为强烈的线粒体功能障碍能引起更强烈的破骨作用进而导致软骨吸收作用的增强，引发软骨退化。线粒体功能障碍导致的软骨退化促进PTOA 的发展。
PTOA 创伤后慢性退化期的发病机制中，DAMPs 诱导的炎症起重要作用，DAMPs 的释放会对组织稳态造成伤害［34］。慢性退化期，受伤或坏死的软骨细胞释放DAMPs，激活免疫反应并动员修复机制，促进病理性炎症的发生和血管生成，以应对慢性损伤［35］。研究表明，DAMPs 可进一步导致成纤维细胞的局部增殖，从而促进血管的增生［36］。因此，DAMPs及其诱导形成的IL-1β 等促炎症因子在慢性退化期中起着引起病理性炎症和血管增生的作用。研究表明，促炎介质可能在损伤后数月仍然升高，并被认为会导致关节永久性退行性改变。
由于目前PTOA 的发病机制未完全明确，在治疗方法方面，非手术治疗以缓解疼痛为主，手术治疗多进行关节置换手术，尚未出现简单有效的PTOA 治疗方案。综合软骨细胞线粒体在PTOA 中的研究可以发现，软骨细胞线粒体在多种机制的作用下对PTOA 的诱发产生重要影响。因此，通过软骨细胞线粒体方向治疗PTOA 存在广阔的前景。
可通过对软骨细胞线粒体的靶向防护预防PTOA。Szeto-Siller（SS）多肽在撞击后的变性中，通过与心磷脂和细胞色素c 相互作用而靶向对线粒体膜的通透性升高和ROS 的生成产生抑制［37］，从而实现对线粒体的保护作用。同时也在体外模型中被证明具有保存软骨完整性和冲击后软骨细胞活力的能力［38］。这一研究表明，SS 多肽通过对软骨细胞线粒体靶向保护可能成为预防PTOA 的可行途径之一。通过抗氧化剂直接针对线粒体ROS 产生也不失为一种可行的PTOA 预防方法。最近的一项研究使用抗氧化剂甘草查耳酮A（Lico A）限制NLRP3 炎症小体在体外和手术模型OA 中对软骨细胞的损伤［39］。研究表明，Lico A 可通过促进NRF2/ HO-1 轴限制损伤过程中NF-kB 的活化，从而改善软骨细胞损伤和死亡，对PTOA 起到预防作用。此外，通过抗氧化剂减轻ROS 对软骨细胞的损害也可成为预防PTOA 的新途径，研究证实通过纳米粒子向软骨细胞输送抗氧化剂同样具有一定的PTOA 治疗潜力，以及对软骨具有保护作用。这些研究在促进抗氧化剂使用的同时，也证实NLRP3 抑制剂在PTOA 中的可行性。MCC950 作为NLRP3 的一种强效抑制剂，在人类疾病模型中被证明可以安全有效限制NLRP3 活性［38］，有较大潜力作为预防PTOA 的第一线。
综上所述，软骨细胞线粒体在PTOA 的发病过程中起重要作用。发生机械损伤后，在机械生物学因素的参与下关节软骨细胞对损伤作出急性反应，导致线粒体功能障碍，引起炎症，其中涉及DAMPs、NLRP3 炎症小体、IL-1β 等PTOA相关因素，最终导致慢性退化期的软骨退化、PTOA 发生。可以通过对软骨细胞线粒体的靶向防护，减少线粒体ROS 的产生及ROS 对软骨细胞的损害，抑制炎症小体NLRP3 等方法预防治疗PTOA，这为临床上预防治疗PTOA 提供了新思路。
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