刘亚楠 孙枫 涂丽琴 高丹娜 李硕 吴淑华 季英华 郭青云
摘要：
以番茄斑駁花叶病毒（Tomato mottle mosaic virus，ToMMV）外壳蛋白（Coat protein， CP）为研究对象，通过荧光素酶互补技术（Luciferase complementation imaging assay，LCI）研究ToMMV CP与本氏烟组蛋白H4在植物体内的互作情况。亚细胞共定位结果显示，ToMMV CP定位于细胞核和细胞质中，组蛋白H4定位于细胞核中，两者共定位于细胞核中。双分子荧光互补（BiFC）试验结果表明，ToMMV CP与组蛋白H4的互作位置主要在细胞核中。上述2种试验结果证明，烟草花叶病毒CP与本氏烟组蛋白H4在植物体内存在互作。采用病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）技术沉默本氏烟烟草中的H4基因，对沉默H4基因的植株接种ToMMV，接种后第4 d，通过实时荧光定量PCR检测方法检测系统叶的病毒含量，发现病毒含量显著低于对照组，结果表明H4基因的沉默会影响ToMMV在植株中的复制，组蛋白H4可能是ToMMV侵染植株的本氏烟感病因子。病毒编码的CP可能与寄主组蛋白H4在细胞核内发挥作用，进而使病毒完成系统侵染。
关键词：
番茄斑驳花叶病毒；
外壳蛋白；
组蛋白；
蛋白质互作
中图分类号：
S436.412.1+1文献标识码：
A 文章编号：
1000-4440（2023）02-0344-08
Virus infection regulated by interaction between histone H4 of Nicotiana benthamiana and coat protein of tomato mottle mosaic virus
LIU Ya-nan1， SUN Feng2， TU Li-qin2， GAO Dan-na2， LI Shuo2， WU Shu-hua2， JI Ying-hua1，2， GUO Qing-yun1
（1.Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Qinghai University/Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management of Qinghai Province/Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pest in Xining， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Xining 810000， China;2.Institute of Plant Protection， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）
Abstract：
The coat protein （CP） of tomato mottle mosaic virus （ToMMV） was used as the research object， and the interaction between CP of ToMMV and histone H4 of Nicotiana benthamiana was confirmed by luciferase complementation imaging assay （LCI）. Subcellular localization results showed that CP of ToMMV was localized in the nucleus and cytoplasm， histone H4 was localized in the nucleus， and both were co-localized in the nucleus. In the bimolecular fluorescence complementation（BiFC） assay， the interaction sites between CP of ToMMV and histone H4 were mainly in the nucleus. The results of the above two experiments showed that there was an interaction between coat protein and histone H4 of N. benthamiana in plants. H4 was silenced in N. benthamiana by virus-induced gene silencing （VIGS）. Plants with silenced H4 were inoculated with ToMMV， and the virus content in systemic leaves was detected by real-time fluorescence quantitative PCR on the fourth day after inoculation. It was found that the virus content was significantly lower than that of the control group， indicating that the silencing of H4 gene would affect the replication of ToMMV in plants， and histone H4 may be the cause of ToMMV-infected plants. The CP encoded by the virus may play a role in the nucleus with the host histone H4， thereby assisting the virus to complete the systemic infection.
Key words：
tomato mottle mosaic virus；
coat protein；
histone；
protein-protein interaction
番茄斑驳花叶病毒（Tomato mottle mosaic virus，ToMMV）主要侵染茄科和十字花科植物及部分豆科、葫芦科植物[1]。被ToMMV侵染后，番茄植株病叶上往往出现斑驳皱缩等症状，严重者导致番茄叶片坏死，进而影响植株发育，最终影响番茄的品质和产量[2]。
ToMMV属帚状病毒科（Virgaviridae）、烟草花叶病毒属（Tobamovirus）[3-5]，为正义单链RNA（+ssRNA）病毒[6]。番茄斑駁花叶病毒基因组由4个开放阅读框（Open reading frame， ORF）构成，编码4个大小不同的蛋白质[7]，分别为相对分子质量为29 800的运动蛋白（Movement protein，MP）、相对分子质量为17 700的外壳蛋白（Coat protein， CP）[6]、相对分子质量为183 000的RNA依赖型RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase， RdRP）蛋白、相对分子质量为126 000的甲基转移酶/解旋酶蛋白（Methyltransferase/helicase）[8]。对与番茄斑驳花叶病毒同属的烟草花叶病毒属其他成员的研究发现，很多外壳蛋白作为病毒结构蛋白存在[9]，在组装病毒粒子的过程中扮演着非常重要的角色[10]。同时，CP也参与多项生物功能的行使，如病毒运动[11]、病毒致病过程中症状的形成[12]、病毒复制酶在合成负链RNA过程中的位点识别[13]、病毒复制复合物（Virus replication complexes， VRC）的调控[14]等。上述研究结果显示，CP在病毒的侵染循环中扮演着重要角色[15]。但是，目前关于ToMMV CP与寄主植物本氏烟间分子互作的研究还比较少。
组蛋白参与DNA的包装和转录调控，是染色质的主要成分[16]。组蛋白家族包括32个成员，分别是6个H1、11个H2A、8个H2B、5个H3和2个H4 [17]。H3、H4组蛋白在调节染色质的结构和功能方面起着重要的作用[18-19]。在相应酶的作用下，组蛋白会发生甲基化[20]、乙酰化、磷酸化[21]、腺苷酸化、泛素化和腺苷5′-二磷酸（ADP）核糖化等进而达到组蛋白修饰[19，22]。修饰组蛋白会通过适配器分子、染色质修饰酶、转录因子和转录抑制因子读取等影响染色质的组装，从而对转录过程起到调控作用[23]。
本研究利用荧光素酶互补技术（Luciferase complementation imaging assay，LCI）、亚细胞共定位和双分子荧光互补技术（Bimolecular fluorescence complementation，BiFC）验证ToMMV CP与本氏烟H4蛋白的分子互作，并利用病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）技术明确本氏烟H4蛋白在ToMMV侵染过程中的作用，使人们进一步了解ToMMV侵染植物的机制。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
本氏烟植株种植于25 ℃光照培养箱中，16 h/8 h光照/黑暗交替培养。Gateway入门载体pDONR、荧光素酶载体（cLUC、nLUC）、亚细胞共定位载体（pHYG-YFP、pHYG-CFP）、BiFC载体（YN、YC）、农杆菌GV3101感受态菌株和ABI感受态菌株均由笔者所在实验室保存，大肠杆菌TreliefTM5α购自北京Tsingke公司。VIGS载体TRV1、TRV2由笔者所在实验室保存，TRV1、TRV2-GUS、TRV2-PDS、mCherry-H2B、农杆菌菌液由笔者所在实验室保存。
MicroEluteGel Extraction Kit D6294微量胶回收试剂盒、常规质粒提取试剂盒（Plasmid Mini Kit I D6943-2），购自Omega Bio-Tek公司；
克隆载体pMD18-T、T4 DNA连接酶、限制性快切酶，购自宝日医生物技术（北京）有限公司。
1.2 基因克隆与载体的构建
以实验室保存的ToMMV CP和本氏烟cDNA为模板，设计特异性引物（表1）进行目的基因扩增，经BP反应连接到pDONR上后转化大肠杆菌TreliefTM5α，测序正确后，提取质粒，经LR反应连接至终载体cLUC、nLUC、pHYG-YFP、pHYG-CFP、YN、YC[24]上，分别获得质粒cLUC-H4、nLUC-CP、pHYG-YFP-H4、pHYG-CFP-CP、YN-CP、YC-H4。用构建的质粒转化农杆菌感受态后进行PCR检测。设计含有合适酶切位点的引物（表1）对H4基因进行扩增，与同样经过酶切处理的TRV2连接，得到TRV2-H4载体，将其转入农杆菌GV3101中。
1.3 农杆菌接种本氏烟
分别将携带nLUC-CP、cLUC-H4、YFP-H4、CFP-CP、YN-CP、YC-H4、TRV2-H4、TRV2-GUS、TRV2-PDS、TRV1的农杆菌于28 ℃恒温摇床内培养至OD600≈0.6，离心去上清后将菌体分别重悬于悬浮液（10 mmol/L MgCl2、50 mmol/L 2-吗啉乙磺酸pH 5.6、100 μmol/L乙酰丁香酮）中，使其OD600为1.0，于28 ℃恒温培养箱中悬浮1～2 h。在荧光素酶互补试验中以nLUC-CP：cLUC-H4、nLUC-CP：cLUC、nLUC：H4-cLUC、nLUC：cLUC分别共浸润本氏烟叶片。双分子荧光互补试验中以YN-CP：YC-H4共浸润本氏烟叶片。在注射2 d后使用化学发光/荧光图像分析系统进行观察，进行荧光素酶互补分析。在亚细胞共定位和双分子荧光互补试验中，使用激光共聚焦显微镜（ZEISS公司产品，德国）观察注射菌液48 h后的本氏烟叶片。在VIGS试验中，分别以TRV1：TRV2-H4、TRV1：TRV2-GUS（阴性对照）、TRV1：TRV2-PDS（阳性对照）3种组合共浸润接种本氏烟，接种后的本氏烟以TRV-H4本氏烟、TRV-GUS本氏烟（阴性对照）、TRV-PDS本氏烟（阳性对照）命名。每个组合接种7株，以待进行进一步试验。
1.4 实时定量RT-PCR（qRT-PCR）
首先使用TransZol Up Plus RNA试剂盒提取样品RNA，然后将RNA 稀释至相同含量进行反转录（参照说明书），按照比例制备反应液，之后进行定量分析，每个样品设置3个生物学重复，设3个技术重复。
qPCR反应体系（总体积20.0 μl）：10.0 μl 2×SuperFast Universal SYBR Master Mix，0.5 μl正向引物，0.5 μl反向引物，1.0 μl 模板DNA，8.0 μl ddH2O。
qPCR反应程序：95 ℃预变性30 s；
95 ℃变性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，45个循环。熔解曲线：95 ℃ 15 s，95 ℃ 1 min，60 ℃ 15 s。
1.5 Western Blot
取0.1 g本氏烟叶片，用200 μl蛋白质提取缓冲液[0.125 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl），4.00%十二烷基硫酸钠（SDS），20.00%甘油（Glycerol），2.00%巯基乙醇（Mercaptoethanol），0.05% 溴酚蓝（Bromophenol blue）]研磨，于95 ℃、10 min煮沸后置于预冷的4 ℃离心机中，12 000 r/min离心5 min，取上清液，获得蛋白质提取液，取适量蛋白质提取液，进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（130 V，80 min），电泳结束后，电转至聚氯乙烯膜，在室温下置于自动摇床上，于70 r/min孵育1 h，用磷酸盐吐温缓冲液（1×PBST）洗脱3次，每次5 min。以α-ToMMV蛋白质抗体（由笔者所在实验室保存）作为一抗孵化1.5 h后，用1×PBST溶液洗脱3次，每次5 min，用HRP标记二抗（碧云天公司产品，中国）于脱色摇床常温孵育1 h后，再用1×PBST溶液洗脱3次，每次5 min。使用高敏型ECL（化学发光底物）化学发光试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品）检测电转化后的聚氯乙烯膜，取1 ml 化学发光底物（ECL）Buffer A、1 ml ECL Buffer B液体等体积混匀后均匀滴加到电转后的聚氯乙烯膜上，在室温下孵育1～2 min后放在化学发光成像仪器（Tanon 5200全自动化学发光图像分析系统）下观察结果。
2 结果与分析
2.1 本氏烟组蛋白基因H4的克隆及组蛋白H4特征分析
H4基因全长312 bp（图1A），编码1个由102个氨基酸组成的蛋白质（相对分子质量为11 400），该蛋白质具有1个保守的组蛋白折叠域（HFD）[25]，其中包含3个串联的α-螺旋，两端是N末端、C末端，这2个区段易发生转录后修饰，对基因转录的调控作用明显[26]，组蛋白H4的結构见图1B。
2.2 ToMMV外壳蛋白（CP）与组蛋白H4的互作验证
近年来，荧光素酶互补成像（Luciferase complementation imaging，LCI）技术因具有可量化、高灵敏度的特征而在蛋白质互作试验中被广泛使用[26]，本试验拟通过此方法分析CP与组蛋白H4之间的互作关系。nLUC-CP与cLUC-H4共浸润本氏烟，2 d后对烟草叶片喷施荧光素酶，用化学发光成像系统观察荧光素酶的活性。如图2A所示，与含有空载体的农杆菌一起被浸润的所有阴性对照中，荧光信号都没有被检测出来，只有共表达的nLUC-CP+cLUC-H4试验组能检测到明显的荧光信号。上述结果表明，ToMMV CP与组蛋白H4能在烟草细胞中发生相互作用。
为了进一步验证CP与组蛋白H4在植物体内的互作情况，笔者将CP基因、H4基因分别连入双分子荧光互补（BiFC）载体YN、YC中，用农杆菌浸润烟草叶片2 d后，通过激光共聚焦观察本氏烟细胞内的黄色荧光。BiFC结果表明，YN-CP和YC-H4共浸润烟草叶片后可以在细胞核位置观察到点状YFP荧光，表明ToMMV CP和组蛋白H4能够在烟草叶片细胞中互作，其他组合均未观察到荧光（图2B）。
2.3 ToMMV CP和本氏烟组蛋白H4的亚细胞定位
为了明确ToMMV CP及本氏烟组蛋白H4的亚细胞定位，本研究分别构建pHYG-CFP-CP、pHYG-YFP-H4重组表达载体。用含有pHYG-CFP-CP、pHYG-YFP-H4质粒的农杆菌菌液和含有mCherry-H2B质粒的农杆菌菌液共浸润本氏烟叶片，其中mCherry-H2B的主要作用为细胞核红色荧光标记，接种后2 d，通过激光共聚焦显微镜观察荧光。结果显示，ToMMV CP定位于细胞核、细胞质中，组蛋白H4定位于细胞核中（图3A），两者共定位于细胞核中（图3B）。
2.4 本氏烟沉默H4基因抑制ToMMV的侵染
为了进一步明确组蛋白H4对ToMMV侵染植株的影响，利用TRV诱导的基因沉默技术沉默H4基因，以TRV-GUS、TRV-PDS为对照，TRV-H4通过农杆菌浸润对六叶期的本氏烟进行H4基因沉默，相关结果见图4。当阴性对照TRV-PDS出现白化症状时，取试验组的系统叶进行实时荧光定量PCR，检测H4基因的沉默效率。结果显示，H4基因的相对表达量显著下降（图4B）。
对沉默后的植株浸润接种ToMMV，并于接种后第4 d取其系统叶进行实时荧光定量PCR以检测病毒含量。结果表明，H4基因沉默后，ToMMV CP基因在本氏烟中的积累量降低（图4A），病毒在系统叶中的复制水平显著低于对照（图4B），表明H4基因的沉默会影响ToMMV的侵染，组蛋白H4可能是ToMMV侵染植物的感病因子。
3 讨论
病毒外壳蛋白的主要功能是形成衣壳，保护病毒基因组，以防降解［27］。然而，除了结构功能外，外壳蛋白在病毒的感染周期和寄主植物对病毒感染的防御反应中还有许多其他重要功能[28]，包括参与病毒的蚜传[29]、病毒的长距离运动[30]和胞间运动[31]、病毒症状的形成等[32-33]。以此可见，CP在病毒侵染植株的过程中发挥了重要作用，因此研究CP的互作因子对了解病毒侵染过程及其致病机制有着十分重要的意义[34]。已有的研究结果表明，水稻矮缩病病毒外壳蛋白P2可以与植物体内恩特-贝壳杉烯氧化酶（Ent-kaurene oxidases）互作，导致水稻产生矮缩症状[35]。Li等[36]研究發现，烟草IP-L与烟草花叶病毒（ToMV）CP间存在相互作用，ToMV CP同IP-L的互作会影响植物的光合作用，从而引起植株黄化症状。黄瓜绿斑驳花叶病毒外壳蛋白与烟草RPL14存在互作，这种互作可能会影响病毒的增殖机制[37]。本研究选择番茄斑驳花叶病毒CP作为诱饵筛，在烟草中筛选到与其互作的组蛋白H4，这是关于ToMMV CP与植物组蛋白互作的首次报道，为ToMMV CP功能的后续研究奠定了基础。
组蛋白是构成真核生物染色体的基本结构蛋白[38-39]，在某些情况下组蛋白中的特定氨基酸位点可发生甲基化、乙酰化等表观遗传学修饰[40]。在表观遗传调控中，这些不同位点的不同修饰作用是不一样的[41]。研究发现，酿酒酵母组蛋白H4 K16位点与酵母乙酸耐受性相关[42]。对拟南芥的研究发现，通过减少开花抑制因子FLC的组蛋白H4赖氨酸5（H4K5ace）的乙酰化，会使植物提前开花[43-44]。此外，组蛋白H4的乙酰化是基因表达激活的标志，这些标志在动物病毒基因组特别是动物病毒基因激活和再激活的调控区域的富集，是病毒从感染潜伏状态到烈性感染状态转变的重要因素[45]。本研究在沉默本氏烟H4后发现，ToMMV的侵染能力下降，表明H4在ToMMV与寄主互作的过程中发挥重要作用，由此笔者推测，病毒编码的CP在细胞核内通过影响组蛋白的修饰等，进而使病毒完成系统侵染。
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（责任编辑：徐 艳）