蒋莹莹,张 华,雷志伟,3,徐 恒,张 恒,朱 英,*
(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004; 2.浙江省农业科学院 病毒学与生物技术研究所,农产品质量安全危害因子与风险防控省部共建国家重点实验室,浙江省作物分子育种工程技术研究中心,浙江 杭州 310021; 3.浙江农林大学 现代农学院,浙江 杭州 311300)
植物高度分化的成熟组织或细胞通过激素刺激和离体培养再次形成完整植株的过程是植物的一种再生过程。植物再生主要存在两种方式,一种是通过激素刺激直接产生芽和根,然后再形成完整植株;而另外一种则是植物组织在激素的刺激下先形成愈伤组织,然后愈伤组织经过分化形成体细胞胚后,再通过生长发育形成植株[1-3]。其中第二种再生方式对于水稻和小麦等作物基于农杆菌介导的转基因技术的应用尤为重要,因为这些作物的转基因效率与愈伤组织的质量和胚性愈伤的分化效率高度相关[4]。不同植物的再生效率存在显著差异,如烟草、胡萝卜和拟南芥等植物再生效率较高,而小麦、玉米和大豆等作物的再生效率却明显偏低[5]。同种植物不同亚种间的再生效率也存在明显差异,如亚洲栽培稻中粳稻品种的再生效率普遍高于籼稻品种,由此表明,基因型差异可能对植物再生效率具有重要影响作用[6-7]。
植物再生过程中,生长素(indole-3-acetic acid, IAA)和细胞分裂素(cytokinin, CTK)的作用最先被人们发现。1957年,Skoog等[8]通过调节培养基中IAA和CTK的比例,第一次成功实现对植物器官形成的人为控制,从而表明植物再生过程中IAA和CTK具有重要作用。已有结果表明,植物体中IAA主要通过ARF-LBD-E2Fa信号传递途径促进离体组织形成愈伤[9]。ARF(auxin response factor)是一类转录因子基因,它们在IAA信号途径中具有重要作用[10]。拟南芥arf7arf19双基因突变体对IAA不敏感,在含有2,4-D(一种人工合成生长素)的诱导培养基中无法形成愈伤组织。LBD(lateral organ boundaries domain)也是一类转录因子基因,其表达受ARF基因的直接调控。过表达LBD16、LBD17或LBD29可恢复arf7arf19双突变体的愈伤组织形成能力[11]。E2Fa是LBD的下游基因,它们可以与细胞周期蛋白结合促进植物愈伤组织形成[12]。愈伤分化过程中,CTK可以平衡IAA的作用,并促进芽的再生。拟南芥CTK信号传递主要通过HK-HP-ARR分子途径向下传递[13]。HK(histidine kinase)是CTK的受体。在CTK刺激下,HK将磷酸基团传给HP(his-containing phosphotransfer)后再转移给ARR(arabidopsis response regulator)。ARR是一类转录因子基因,B类ARR在发生磷酸化后可以激活细胞周期蛋白基因CYCDs(D-type cyclin)的表达,从而促进愈伤进行分化[14-15]。
除IAA和CTK外,人们通过对植物伤口处自然形成的愈伤研究发现茉莉酸(jasmonic acid, JA)也是影响植物再生的另外一种重要激素[16-18]。植物在受到外界伤害后,伤口处的JA含量会快速上升,而JA又可以通过COI1-MYC2-ERF115分子途径促进愈伤组织形成[18-19]。拟南芥中,COI1是JA的受体基因。在受到JA刺激后,COI1(coronatine insensitive 1)可以与JAZ(jasmonate ZIM-domain)蛋白结合,促使后者进入泛素化降解途径。JAZ蛋白降解后,MYC2的转录活性被重新释放[20],激活ERF115(ethylene response factor 115)的表达,而ERF115又可激活SCN(stem cell niche)等基因的表达,最终促进植物进行再生[18]。
水稻中,OsMYC2(LOC_Os10g42430)也是JA信号传递途径中的核心转录因子之一[21]。水稻依赖于OsMYC2的JA信号传递途径与拟南芥较为类似。受体OsCOI1b在与JA结合后可以促使OsJAZs蛋白发生降解,从而解除对OsMYC2转录活性的抑制,激活下游JA信号响应基因的表达[21]。基因功能研究结果表明,OsMYC2是水稻抗病能力的正向作用因子,过表达OsMYC2,水稻白叶枯病、条纹叶枯病和稻瘟病抗性均获得显著性提高[22-26]。不过,OsMYC2的过量表达也会导致叶绿素代谢基因表达上调,从而导致水稻植株发生早衰[27]。此外,OsMYC2也可通过MADS类转录因子影响水稻的小穗发育。当OsMYC2的功能被抑制时,水稻OsMADS1、OsMADS7和OsMADS8基因的表达明显下调,小穗发育发生异常[21]。目前,水稻JA信号传递基因在再生过程中是否也存在与拟南芥类似的功能尚不清楚。因此,本研究对OsMYC2基因在水稻再生过程中的作用开展研究,同时对水稻ERF115同源基因的表达进行鉴定分析,以了解JA信号途径基因对水稻成熟胚愈伤组织形成和分化的影响,从而为进一步提高水稻转基因效率提供新的思路和理论依据。
1.1 水稻材料的鉴定
本研究所用的野生型水稻材料为粳稻品种日本晴(Nipponbare,NIP),osmyc2基因编辑突变体材料种子由浙江省农业科学院洪高洁研究员友情提供[23]。该突变体材料以日本晴为受体构建。将水稻种子播种和移栽后,对各水稻单株进行取样和基因组DNA提取,并通过PCR扩增和测序确定野生型和突变体单株中OsMYC2基因的序列变异情况。待水稻种子成熟后,进行单株收获,所收获的野生型和osmyc2纯合突变体种子用于后续成熟胚组织愈伤的诱导和分化试验。
1.2 水稻成熟胚愈伤组织的诱导和分化
本研究以水稻成熟胚为材料,通过组织培养进行愈伤诱导和分化。主要操作过程如下:为了减少机械外力对胚活性的损失,成熟的水稻种子进行手工去壳,然后选取健康的水稻种子进行消毒和清洗。水稻种子首先通过75%乙醇(约1 min)去除表面细菌后,再通过30%次氯酸钠(约20 min)进行深度灭菌。消毒好的种子通过无菌去离子水清洗若干次(5～7次)后,再在灭菌后的滤纸上吸干剩余水分,最后将种子放入诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养(30～35 d)。诱导培养基以NB培养基(Coolaber)为基础培养基,外加2 mg·L-12,4-D。愈伤组织诱导期间,对愈伤组织进行观察、取样和拍照,培养约32 d时根据形成的愈伤组织大小和胚性愈伤的数量进行计分,以展示野生型日本晴和osmyc2突变体的愈伤诱导效率。
待野生型对照日本晴产生较多胚性愈伤后,挑选日本晴和osmyc2突变体的胚性愈伤移入分化培养基中培养45 d。分化培养基以NB培养基(Coolaber)为基础培养基,外加3 mg·L-16-BA和0.5 mg·L-1NAA。愈伤分化期间,对愈伤组织进行观察、取样和拍照,分化约42 d时根据愈伤组织的扩散程度和完整植株的形成数量进行计分,以展示野生型日本晴和osmyc2突变体的愈伤分化效率。
1.3 水稻愈伤组织样品的获取
为了调查OsMYC2基因在水稻再生过程中的表达情况,我们在日本晴成熟胚愈伤组织诱导和分化期间进行了连续取样。愈伤诱导期间,从愈伤组织开始形成时,即诱导培养基中第9天进行第一次取样。随后,每隔一天取样一次,即诱导期第11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31 天时进行取样。愈伤分化期间,在培养第2、4、6、8、10、12、14、19、24、26、28和30天时进行取样。愈伤组织诱导和分化期间,每次愈伤组织取样均在当天下午3:00左右进行,每个时间点的样品取5个重复。所取愈伤组织放入液氮速冻后转入超低温冰箱进行保存。为了调查OsMYC2可能的下游基因的表达情况,在分化期第24天对osmyc2突变体的愈伤组织也进行取样,取样时间和生物学重复与日本晴相似。
1.4 愈伤组织样品RNA的提取和反转录
愈伤组织的总RNA利用英俊公司的TRIzol reagent进行提取。具体方法如下:在1.5 mL的RNase-Free EP管中加入1 mL Trizol(Invitrogen),取50～80 mg的愈伤组织放入EP管中,用电动研磨器充分研磨后室温静置5 min。4 ℃,12 000 r·min-1离心10 min,吸取上清至一新的1.5 mL的RNase-Free EP管中。加入200 μL氯仿,剧烈振荡15 s,室温放置5 min。4 ℃,12 000 r·min-1离心10 min,吸取上清至新的RNase-Free EP管中,加入2.5倍体积的预冷的无水乙醇,颠倒混匀后冰上放置10 min。4 ℃,13 000 r·min-1离心15 min后弃去上清,用75%乙醇洗涤后,离心弃上清。待沉淀干燥后,加入适量的RNase-Free水溶解沉淀,即为提取的RNA粗样品。用琼脂糖凝胶电泳对RNA粗样品进行品质鉴定。抽提所获得的RNA粗样用英俊公司TURBO DNA-freeTM试剂盒进行消化,以彻底消除残留基因组DNA。取50 μL RNA粗样,加入5 μL反应缓冲液(10×), 再加入1 μL DNAase。混匀后放入37 ℃培养箱进行温浴,25 min后取出样品待冷却至室温(25 ℃)后加入5 μL reactive反应液,室温下反应5 min,并进行间断性混匀。反应完后,4 ℃,12 000 r·min-1离心3 min,吸取上清即为消化完成的RNA样品。
消化后所获得RNA精样用Promega的GoScriptTM 反转系统进行反转录,以获得第1链cDNA。冰上配置如下反应液:RNA 样品约1 μg;Oligo dT Primer,1 μL;加入DEPC水到最终体积5 μL。70 ℃变性5 min后,直接置于冰上。配置反转录预混液:DEPC水,6 μL;ImProm-Ⅱ 5×Reaction Buffer,4 μL;MgCl2(25 mmol·L-1),2.5 μL;dNTP mix(10 mmol·L-1each dNTP),1 μL;RNA抑制剂,0.5 μL;ImProm-Ⅱ Reverse Transcriptase,1 μL。混匀预混液后,分装15 μL到每个已变性过的样品中,再混匀。25 ℃放置5 min后,42 ℃反应1 h。70 ℃高温失活10 min,将反转好的cDNA置于冰上或放入-20 ℃冰箱中长久保存。
1.5 基因表达分析
qRT-PCR定量表达分析主要是利用Bio-rad 公司的C1000定量分析仪和 SYBR®Green Supermix反应液完成。基因定量表达分析采用的内参为水稻Actin基因[28],每个样品重复3～5次,目标基因相对表达量通过△CT方法计算获得。基因定量表达分析所用引物序列见表1。样本间的数据差异显著性分析结果通过t-测验获得。
表1 用于基因表达鉴定的引物序列信息Table 1 Oligonucleotide primer sequences used for gene expression analysis
2.1 OsMYC2基因在成熟胚愈伤组织诱导和分化期间的表达情况
观察发现,日本晴成熟种子在诱导培养基中培养第9天时,愈伤组织开始形成。随着愈伤组织逐步长大,在培养后期(第25天后)开始出现胚性愈伤。基因表达分析结果表明,愈伤形成初期(第9～15天)OsMYC2基因的表达量相对较高;而愈伤诱导中期(第15～19天),OsMYC2的表达量出现一段明显的下降过程;胚性愈伤开始形成后(第25～31天),OsMYC2的表达量又出现一定的上升,并在这一阶段保持相对稳定(图1-A),由此我们推测OsMYC2的表达对水稻胚性愈伤的形成可能存在一定促进作用。
A-OsMYC2基因在水稻愈伤诱导期的表达情况;B-OsMYC2基因在水稻愈伤分化期的表达情况;C-水稻愈伤分化期的表型图。A, Expression analysis of OsMYC2 in callus cultured in the induction medium; B, Expression analysis of OsMYC2 in callus cultured in the differentiation medium; C, Phenotype of callus in the differentiation medium.图1 OsMYC2基因在水稻再生过程中的动态表达情况Fig.1 Dynamic expression analysis of OsMYC2 in regeneration process of rice
在愈伤分化期间,日本晴愈伤组织中OsMYC2的表达则比较活跃,普遍高于诱导期的愈伤。在分化培养早期(第4天),OsMYC2的表达量相对较低;而在第8天,即部分愈伤出现明显绿点,体细胞胚开始形成时(图1-C),OsMYC2的表达量开始上升。愈伤分化中期(第12～24天),体细胞胚的形成和发育逐渐进入繁盛期(图1-C),相应地,OsMYC2的表达量也最为丰富(图1-B)。根据上述结果,我们推测OsMYC2在水稻成熟胚愈伤组织的诱导和分化过程中可能均存在一定作用,其中分化期的作用更为重要。
2.2 OsMYC2基因影响水稻成熟胚愈伤组织的诱导和分化
本研究中采用的osmyc2突变体材料共有3个系(osmyc2-2、osmyc2-3和osmyc2-6)。以水稻基因组为模板对编辑靶位点测序,结果表明,3个osmyc2突变体材料的OsMYC2基因序列变异属于同一个编辑位点不同形势突变。与野生型日本晴序列进行比较,osmyc2-2在编辑位点处插入1个碱基,而osmyc2-3和osmyc2-6分别缺失4和7个碱基。3种突变均导致OsMYC2基因在翻译时发生提前终止,它们产生的短肽分别含有55、60和61个氨基酸残基。蛋白质序列比对结果显示,osmyc2-2编码的55个氨基酸残基与野生型OsMYC2蛋白N端的55个氨基酸残基完全一致;而osmyc2-3和osmyc2-6的前57个氨基酸残基与OsMYC2蛋白N端的57个氨基酸残基相同,但剩下的3和4个氨基酸残基存在差异(图2-A)。同时,我们利用qRT-PCR技术对突变体中OsMYC2基因的表达进行了鉴定,结果显示,OsMYC2基因在osmyc2-2、osmyc2-3和osmyc2-6突变体分化期愈伤中的表达均明显低于野生型日本晴愈伤中的表达(图2-C),表明osmyc2的基因编辑位点可能也影响OsMYC2基因在水稻愈伤中的表达。
A,osmyc2基因编辑突变体的基因组序列变异和根据DNA序列预测所获的蛋白质序列变异情况。OsMYC2基因组序列变异展示图中,红色和绿色字母分别表示插入和缺失的碱基。OsMYC2蛋白序列展示图中,红色字母表示不同的氨基酸残基,55和57表示该氨基酸残基位于OsMYC2蛋白序列的位置;B,野生型对照日本晴和osmyc2基因编辑突变体在分化第30天时的表型图;C,野生型日本晴和osmyc2突变体分化期(第24天时)愈伤组织中OsMYC2基因的表达情况;D,野生型日本晴和osmyc2突变体成熟胚愈伤组织诱导效率的统计结果;E,野生型日本晴和osmyc2突变体胚性愈伤的分化效率统计结果;**代表样品与野生型NIP之间存在显著性差异P<0.01。A, Genomic and protein sequence of OsMYC2 in wild type (NIP) and osmyc2 mutant. The red and green letters in the genomic sequence of OsMYC2 represent insert and deleted nucleotide bases, respectively. The red letters in the OsMYC2 Protein sequence represent different amino acid residue and the number means 55 and 57 amino acid residue from N-terminal of OsMYC2 Protein; B, Callus phenotype at 30 days after differentiation of wild type Nipponbare (NIP) and osmyc2 mutant; C, Expression of OsMYC2 in wild type NIP and osmyc2 mutant callus cultured in the differentiation medium; D, Callus induction efficiency of wild type NIP and osmyc2 mutant; E, Embryogenic callus differentiation efficiency of wild type NIP and osmyc2 mutant; ** represents significant difference at the 0.01 levels (t-test).图2 野生型日本晴(NIP)和osmyc2基因编辑突变体的基因型和表型鉴定结果Fig.2 Genotype and phenotype of wild type rice Nipponbare (NIP) and osmyc2 mutant
为了分析OsMYC2基因是否影响水稻愈伤的诱导和分化,我们对日本晴和osmyc2突变体种子进行了成熟胚愈伤组织的诱导和分化实验。根据愈伤组织大小和胚性愈伤数量,我们对野生型日本晴和osmyc2突变体的愈伤诱导效率进行了计分和统计分析。结果显示,osmyc2突变体的愈伤诱导效率(47.2%～72.3%)均显著低于野生型日本晴(NIP,89.6%),其中osmyc2-6的诱导效率最低(图2-D),由此表明,OsMYC2在水稻成熟胚愈伤组织的诱导过程中可能对胚性愈伤的形成具有一定促进作用。随后,将osmyc2突变体和野生型水稻品种日本晴的胚性愈伤转入分化培养基中进行分化培养。通过观察发现,osmyc2突变体的分化效率明显低于野生型对照(图2-E)。根据愈伤扩增数量和水稻再生植株的形成效率,我们对各组愈伤进行计分和统计分析,结果显示3个osmyc2突变体的愈伤分化效率(32.6%～62.3%)均显著低于野生型日本晴(NIP,91.3%)。与诱导培养类似,突变体osmyc2-6的愈伤分化效率最低(32.6%),而突变体osmyc2-2的愈伤分化效率较高(62.3%),osmyc2-3的愈伤分化效率与osmyc2-6较为接近,为39.6%(图2-E)。综合以上结果,我们推测在水稻成熟胚愈伤组织的诱导和分化过程中,OsMYC2的表达不仅影响胚性愈伤的形成,同时也影响胚性愈伤的分化。
2.3 OsMYC2基因影响水稻愈伤分化效率潜在下游基因的表达分析
拟南芥中,ERF115是JA和IAA影响再生分子途径中的共同基因[18,29]。ERF115可以激活WOX5和SCN等基因的表达,从而促进植物进行再生。由于拟南芥JA信号途径中,ERF115位于COI1和MYC2的下游[18],因此我们推测OsMYC2也可能通过ERF115在水稻中的同源基因影响成熟胚的愈伤诱导和分化。蛋白质序列比对结果表明,水稻基因组中与拟南芥ERF115相似的同源基因可能有2个[30-31],它们分别是OsERF101/OsRap2.6和OsERF60/OsRLP2.6L。我们利用日本晴和osmyc2突变体分化期愈伤组织进行基因表达分析。取样时间点为水稻愈伤分化培养第24天,此时野生型愈伤组织中OsMYC2基因的表达最为活跃。利用qRT-PCR技术,对OsERF101和OsERF60进行基因表达分析,结果表明,OsERF101和OsERF60基因在愈伤组织中的表达丰度较高,OsERF60的表达明显高于OsERF101。而与野生型相比,OsERF101和OsERF60在osmyc2突变体中的表达均显著下降,其中OsERF101的下降幅度更大(图3-A和B)。
N.S.代表样品与野生型NIP之间无显著性差异,*代表样品与野生型NIP之间存在显著性差异P<0.05,**代表样品与野生型NIP之间存在显著性差异P<0.01。N.S. represents no difference and *, ** represents significant difference at the 0.05 and 0.01 levels (t-test), respectively.图3 野生型日本晴(NIP)和osmyc2突变体愈伤中OsERF101(A)、OsERF60(B)、OsWUS(C)、OsBBM1(D)、OsBBM2(E)、OsWOX5(F)的基因表达结果Fig.3 Expresssion analysis results of OsERF101 (A), OsERF60 (B), OsWUS (C), OsBBM1 (D), OsBBM2 (E) and OsWOX5 (F) in callus of wild type rice Nipponbare (NIP) and osmyc2 mutant
这一结果表明,水稻中的OsERF101和OsERF60与拟南芥的ERF115相似,可能也参与了植物再生过程。而根据基因表达水平的变化幅度我们推测OsMYC2可能调控OsERF101在愈伤中的表达。
同时,由于OsMYC2基因缺失后水稻体细胞胚的形成效率显著下降,因此我们对OsBBM和OsWUS等可能影响水稻胚胎发育的基因的表达进行了鉴定。水稻基因组中有4个与拟南芥BBM同源的基因[32],它们分别是OsBBM1、OsBBM2、OsBBM3和OsBBM4。qRT-PCR结果表明,OsBBM1和OsBBM2在愈伤组织中的表达比较高,而OsBBM3和OsBBM4则丰度很低,因此我们对水稻OsBBM1和OsBBM2基因的表达结果进行了比较分析。结果显示,所有osmyc2突变体中OsBBM2基因表达水平均显著低于野生型对照日本晴;OsBBM1除了在osmyc2-2中表达与日本晴无显著差异外,在osmyc2-3和osmyc2-6中的表达也明显下降(图3-D和E)。随后,我们分别对拟南芥中的再生标记基因WUS[33]和WOX5[34]在水稻中的同源基因OsWUS和OsWOX5进行了表达分析[35-36]。结果表明,OsWUS和OsWOX5在水稻愈伤中的表达均较高,且它们在野生型日本晴愈伤中的表达水平与OsBBM2较为相似。通过与突变体的比较,我们发现osmyc2突变体愈伤中OsWUS和OsWOX5的表达与日本晴均存在显著差异。但是,OsWUS和OsWOX5的表达变化趋势却并不相同。OsWUS在osmyc2突变体中的表达明显下调(图3-C),而OsWOX5在osmyc2突变体中的表达则显著上升(图3-F),由此表明,OsMYC2基因可能同时影响OsWUS和OsWOX5在水稻愈伤中的表达,但是调控方向可能是相反的。
综合以上结果,可以看出水稻OsMYC2基因缺失后,分化第24天时的愈伤组织中OsERF101、OsBBM2和OsWUS的表达均显著下降。由于水稻OsERF101与拟南芥ERF115基因的同源,且拟南芥MYC2可通过ERF115影响植株再生。同时,BBM和WUS等基因可以显著影响拟南芥的再生。因此,我们推测OsMYC2影响水稻愈伤诱导和分化的分子机制与拟南芥较为相似,可能主要通过OsERF101、OsBBM2和OsWUS等基因影响水稻的再生过程。
60多年前,Skook等[8]通过对植物组织体外培养成功实现植物再生,从而证明IAA和CTK是控制植物再生的重要激素。而通过对自然界天然形成的植物愈伤的深入研究,人们又发现另一个激素JA在植物再生过程中扮演关键角色[16-18]。水稻组织培养过程中,成熟胚可在富含IAA和CTK的培养基上成功实现再生,因此IAA和CTK也是影响水稻再生的重要激素,但是JA信号途径基因是否参与IAA和CTK主导的水稻再生过程人们并不清楚。
OsMYC2是水稻JA信号传递途径中的重要基因之一[21]。在本研究中,我们对JA信号途径基因OsMYC2对水稻成熟胚愈伤组织的诱导和分化的影响进行了探索。当JA相对缺乏时,OsMYC2的转录活性被OsJAZs蛋白抑制;而当体内JA含量较高时,受体蛋白OsCOI1b在JA的刺激下与OsJAZs结合,并促使OsJAZs蛋白通过泛素化途径进行降解,因此OsMYC2的转录活性获得释放,从而激活下游基因的表达[21]。通过基因表达分析,我们发现OsMYC2基因在水稻愈伤的诱导和分化过程均存在一定量的表达,而且愈伤分化期间的表达量相对较高,尤其是在愈伤分化培养过程的体细胞胚形成高峰期(第12～24 天)OsMYC2基因的表达最为活跃(图1-B),这些结果暗示OsMYC2基因可能参与水稻愈伤的诱导和体细胞胚的形成过程。遗传研究结果验证了这一想法,结果显示,当OsMYC2基因缺失后,水稻成熟胚愈伤组织的诱导效率和胚性愈伤的分化效率均显著下降(图2-E),由此表明,OsMYC2对于水稻愈伤组织诱导和分化可能均具有一定促进作用。
在JA影响植株再生的途径中,拟南芥MYC2的下游基因是ERF115[18]。ERF115也是一种转录因子基因,序列相似性结果表明,水稻中存在2个与拟南芥ERF115可能同源的基因OsERF101和OsERF60[30-31]。基因表达结果显示,osmyc2突变体中OsERF101和OsERF60均显著下降,而OsERF101下降的相对幅度更大(图3-A和B),且OsERF101与拟南芥ERF115的相似性较高,因此我们推测,OsMYC2通过OsERF101影响水稻再生的可能性较大。目前,OsERF101是否参与水稻再生过程的研究尚不清楚,相关的研究结果尚无报道,因而下一步我们计划对OsERF101在水稻再生过程中的作用进行研究。由于osmyc2突变体的愈伤分化效率显著低于野生型对照日本晴,因此我们推测部分参与体细胞胚形成的重要基因可能也受OsMYC2调控。随后,我们对OsBBMs和OsWUS等基因[32,35-36]进行了基因表达分析。在拟南芥和玉米等植物中,BBM和WUS基因对体细胞胚的形成具有重要作用。过表达玉米中的BBM和WUS2可以显著提高玉米、高粱和水稻等作物的体细胞胚的形成效率[37]。本研究的基因表达分析结果显示,OsBBM2和OsWUS在osmyc2突变体愈伤中的表达均显著下降(图3-C和E),因而我们认为osmyc2突变体愈伤中体细胞形成效率的下降可能与OsBBM2和OsWUS的基因表达显著下降有关。启动子序列分析结果显示,OsERF101、OsBBM2和OsWUS基因启动子上均存在多个OsMYC2蛋白结合的G-box顺式元件,其中OsERF101启动子上含有的G-box顺式元件最多,有15个;而OsBBM2启动子上含有11个OsMYC2蛋白结合序列;OsWUS基因启动子上含有的G-box顺式元件较少,只有5个,因此OsMYC2存在直接调控OsERF101、OsBBM2和OsWUS基因表达水平的可能。我们未来将通过酵母单杂交和EMSA等实验手段对OsMYC2直接调控的下游基因进行鉴定和验证。以上结果表明,JA信号途径基因可能参与了水稻成熟胚愈伤组织的诱导和分化过程,并在这一过程中起正向促进作用,从而为JA在水稻转基因效率提高中的应用提供一定的理论指导。
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